深度：如何生物3D打印管腔（血管）结构？

来源： 上普生物

导读：随着组织工程领域的不断发展，不断有新的技术涌现出来，用于解决目前器官构建中出现的痛点与难点。同轴生物3D打印技术的出现让我们对血管化、精细化的组织器官打印提供了更多的可能性。本文带您深入浅出的看懂这种技术和未来的发展空间。

组织工程
组织工程这一概念源于20世纪80年代中期，此项技术是指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。这一基本技术路线使组织工程的研究能够克服以往在临床应用的非活性的替代物的诸多缺点，使组织工程的研究在全世界范围内迅速得到了广泛的关注。目前组织工程的研究已经在构建皮肤、软骨、肝脏、胰腺、骨、肌肉、血管和神经等组织器官方面取得了进展。

生物3D打印技术是构建组织和类器官的新兴技术，此项技术运用增材制造的思维，可以构建含有活细胞的复杂三维结构。近几年，此项技术已取得了长足的进展，然而随着我们对于人造组织的精度、复杂度的不断挑战，过去通用的技术已经难以满足我们的需求，我们需要新的打印方法来解决组织器官构建诸多问题和局限性。

当前技术的局限性与出路
当前技术的局限性
利用当前的通用3D打印技术所构建的组织器官具有以下几种局限性：

• 虽然我们可以将细胞或材料堆积成三维结构，所打印的组织和类器官的血管化是组织工程的难点所在，传统生物打印工艺采用线材螺旋堆积的形式进行管腔结构的打印，但是这样的工艺仅能够形成管腔结构，难以实际应用。所以，如何在人造组织中构建出具有功能性的血管网络或血管结构是推进组织工程向临床发展的一大瓶颈。
• 人体的组织器官形态多种多样，其中很大一部分是具有复杂层次的结构（如皮肤的表皮、内皮细胞的分层结构；肠道、尿道的管腔结构等）。而生物3D打印作为一种构建生物仿生结构的工艺，需要一项可以构建复杂层次或管腔结构的工艺技术。
• 微挤出式生物3D打印工艺是最广泛使用的打印工艺，因为其可以打印多种细胞和生物材料，并保有良好的细胞活性。但是，由于水凝胶类材料的挤出胀大，此工艺的精度往往有所限制。
• 低黏度材料（如海藻酸钠）的打印往往困难重重，对于这类材料，交联固化的时机尤其重要：提前固化会导致打印喷头的堵塞；后期固化会导致结构体精度较差。所以亟需一项可以对低黏度材料进行原位固化的技术。
  

管腔结构：传统工艺（左）vs 同轴工艺（右）

同轴工艺解决方案
同轴喷头系统是将生物3D打印机的两个或多个喷嘴部分，像“俄罗斯套娃”一样组合起来，以解决上述生物3D打印的各种痛点：

• 由于同轴喷头可以轻松地实现管腔结构的打印，所以在构建组织的血管化方面又有了新的突破。
• 同轴喷头技术由于其天生的多材料复合的特点，可以用于构建具有层次或是管腔结构的打印。
• 由于同轴喷头可以实现喷嘴出口处的快速交联，所以此项技术可以构建精度较高的结构。
• 同样，基于同轴喷头原位交联的特点，低黏度的生物墨水打印的成功率和精度更高，有效的扩充了应用的材料范围。哈佛大学医学院就是利用这样的技术实现了高精度且低黏度的墨水打印
  

高精度、低黏度的同轴打印

Colosi C , Shin S R , Manoharan V , et al. Microfl uidic Bioprintingof Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink[J]. AdvancedMaterials, 2016, 28(4):677-684.

应用案例
同轴喷头技术的使用大大拓展了我们对于生物3D打印的想象空间，诸多研究者已经开始应用这项技术领域进行耕耘，并在不同的组织或器官方面取得了进展，下面我们来分享其中几篇典型案例：

软骨组织
软骨的自愈能力和创伤响应性较差，往往需要三维组织工程支架辅助修复。由波兰华沙工业大学的Wojciech Święszkowski课题组于Biofabrication发表多篇文章，均利用各类光敏材料如GelMA、CS-AEMA或HAMA，混合海藻酸钠和源自骨髓的人体间充质干细胞（BM-MSC）配置成生物墨水，并利用同轴打印技术，实现墨水中海藻酸钠在喷嘴处的同步交联，以构建具有极高的形态保真度、细胞存活率和机械性能的软骨组织结构，是用于软骨修复的又一有力工具。

Costantini, Marco, Joanna Idaszek, Krisztina Szöke, JakubJaroszewicz, Mariella Dentini, Andrea Barbetta, Jan E. Brinchmann, and WojciechŚwięszkowski."3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitroneocartilage formation." Biofabrication 8, no. 3 (2016): 035002.

肌肉组织
体积性肌肉缺损（VML）是指肌肉出现20%不可逆的缺损，现有技术利用水凝胶和脱细胞基质（dECM）构建三维肌肉组织用于VML的修复，但是疗效仍有局限性。韩国浦项科技大学的Dong-Woo Cho课题组于Biomaterials发表研究成果，将dECM制备成生物墨水，通过同轴喷头将其打印在基于明胶颗粒的悬浮胶中，使其形成外部是血管内皮细胞，内部是肌肉细胞的复杂肌肉组织。实验证明这种肌肉组织具有良好的细胞活性，并增强新生肌肉形成能力，而这种复合结构更可以有效的帮助细胞分化和血管化的形成，并提供更好的功能修复，可以有效的促进VML的疗效。

Choi, Yeong-Jin, Young-Joon Jun, Dong Yeon Kim,Hee-Gyeong Yi, Su-Hun Chae, Junsu Kang, Juyong Lee et al. "A 3D cellprinted muscle construct with tissue-derived bioink for the treatment ofvolumetric muscle loss." Biomaterials 206 (2019): 160-169.

血管组织
构建复杂且具有功能性的人造血管组织结构仍然是组织工程的一大难点。生物3D打印技术可以有效的构建三维血管网络，以促进氧气，营养物质和废物的运输。美国哈佛大学医学院于Biomaterials发表研究，提出了一种可以构建可灌注血管结构的工艺方法。研究团队将光敏材料GelMA、PEGTA与海藻酸钠混合制成生物墨水，通过多层同轴喷头进行打印，实现墨水中海藻酸钠在喷嘴处的同步交联，并直接形成管状结构，后续通过进一步光固化和海藻酸钠洗脱，最终形成可灌注血管结构。这样的复合材料具有良好的生物学性能，有效促进内皮细胞和干细胞在结构中的扩散和增值。这种新技术可以高效构建大尺寸血管化组织的构建，并在未来中应用于器官移植和修复。

Jia, Weitao, P. Selcan Gungor-Ozkerim, Yu ShrikeZhang, Kan Yue, Kai Zhu, Wanjun Liu, Qingment Pi et al. "Direct 3Dbioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink."Biomaterials 106 (2016): 58-68.

细胞免疫研究
调节性T细胞（Treg），其固有的抑制功能是免疫系统的重要调节剂。离体扩增Treg的系统性过继转移已经被广泛研究用于异体移植。由于目前Treg的扩增方法耗时且昂贵，来自澳大利亚阿德莱德大学的Patrick Toby Coates课题组于Advanced Functional Materials杂志发表一项研究，该研究首次报道了用于天然免疫抑制的人天然和诱导的Treg的水凝胶包裹培养。该研究将鼠胰岛与人天然和诱导的Tregs同轴打印，打印体在与人外周血单核细胞共培养后，保护胰岛免受异种反应。这种通过同轴3D生物打印建立了Treg的共包裹培养，是为同种异体细胞移植（例如胰岛）提供局部免疫保护的有效选择。

Kim, J., Hope, C. M., Gantumur, N., Perkins, G.B., Stead, S. O., Yue, Z., … Coates, P. T. (2020). Encapsulation of HumanNatural and Induced Regulatory T‐Cells in IL‐2 and CCL1 SupplementedAlginate‐GelMA Hydrogel for 3D Bioprinting. Advanced Functional Materials,2000544.

未来展望
随着技术水平的不断进步，同轴喷头系统也将取得进一步的拓展和丰富。

目前，已经有研究者实现具有多层次套管组织的打印，多材料的复合使用是同轴喷头技术的下一步方向。UCLA的AliKhademhosseini教授团队，就使用同轴喷头打印了含有多层细胞套管的管腔结构。

Pi, Q.,Maharjan, S., Yan, X., Liu, X., Singh, B., van Genderen, A. M.,Robledo‐Padilla, F., Parra‐Saldivar, R., Hu, N., Jia, W., Xu, C., Kang, J.,Hassan, S., Cheng, H., Hou, X., Khademhosseini, A., Zhang, Y. S., Adv. Mater.2018, 30, 1706913.

通过技术叠加，同轴喷头还可以打印具有梯度浓度的结构体。波兰华沙工业大学的Wojciech Święszkowski课题组通过微流控技术与同轴喷头复合系统进行打印，不仅实现墨水中海藻酸钠在喷嘴处的同步交联，还实现了透明软骨与钙化软骨的分层结构。

Idaszek, Joanna, Marco Costantini, Tommy A.Karlsen, Jakub Jaroszewicz, Cristina Colosi, Stefano Testa, Ersilia Fornetti etal. "3D bioprinting of hydrogel constructs with cell and materialgradients for the regeneration of full-thickness chondral defect using amicrofluidic printing head." Biofabrication 11, no. 4 (2019): 044101.

上普同轴喷头系统

上普新型GelMA墨水
GelMA，甲基丙烯酸化水凝胶(Gelatin Methacryloyl)，是一种光敏水凝胶生物材料。上普新型生物墨水G2，由GelMA与海藻酸钠构成，可以通过上普同轴喷头配合光固化交联实现高精度打印。

关于上普生物

上普成立于2014年，是一家世界领先的高科技公司，由生物3D打印领域创始人之一孙伟教授创办，专门从事生物3D打印和制造先进生物打印产品。基于20多年的研发及经验及公司专利技术，SunP致力于研发创新的3D生物打印系统，新型生物墨水和先进的3D细胞模型并应用于个性化组织工程和癌症治疗，医疗器械，药物测试和新药研发。