挤出式生物3D打印构建高度组织化结构用于骨骼肌组织工程

来源： EngineeringForLife

3D生物打印是一项参与构建组织工程材料的新兴技术，目前已经开发了不同的打印系统。其中，基于挤压的方法被证明最适合骨骼肌组织工程，因为它能够以平行模式生产和沉积印刷纤维，从而很好地模仿天然骨骼肌组织结构。然而，此功能通常与细胞需求（例如细胞粘附和/或吸收性的动机）没有很好的相关性。

为了克服这一障碍，来自罗马大学生物系的C Gargioli联合法国艾克斯-马赛大学的S Testa团队报告了一种新型基于挤出3D生物打印系统的开发和表征及其在小鼠模型中校正体积肌肉损失(VML)损伤的应用。通过基于PEG-纤维蛋白原的使用获得了高度组织化的3D结构，其中小鼠肌肉祖细胞能够分化成排列成对齐束的肌纤维，并且能够在体外培养时自发收缩（图1）。

相关研究成果以“A novel extrusion-based 3D bioprinting system for skeletal muscle tissue engineering”为题于2023年2月3日发表在《Biofabrication》上。

图1 3D 生物打印和本体聚合过程的示意图

1. 生物打印和散装结构中肌纤维成熟、组织和同质性的体外分析
印刷系统在维持细胞粘附、增殖和分化等生物过程中的有效性通过使用鼠类中成血管细胞(Mabs)进行评估。单克隆抗体被添加到由PF组成的生物墨水中，PF是一种结合了天然和合成益处的光固化水凝胶。将获得的生物打印结构在培养物中保存长达30天，以获得完全分化的肌纤维（图2A）。径向位移表明在单个抽搐的收缩阶段发生的位移，在生物打印条件下显着更高（2.5倍）（图2B）。此外，观察到不同的抽搐方向性，平行于生物打印结构中的打印轴，而随机定向在大块结构中（图2B）。

图2 细胞化结构中肌肉分化时程的明场成像

在第30天，在肌肉分化后，针对肌肉分化标记物MyHC和结蛋白的整体免疫荧光分析对大块和生物打印结构进行了分析（图3A）。图像分析证实，PF为Mab的维持提供了有利的微环境，能够在两种条件下增殖和融合以产生大的多核肌纤维（图3B）。通过比较两种条件下的肌纤维宽度、长度和连贯性，评估了生物打印结构中肌纤维尺寸更好组织和更大同质性的证据（图3C）。与体积曲线相比，生物打印结构中的宽度分布似乎向更大的尺寸移动并且更尖锐（图3C）。此外，与大块肌纤维相比，生物打印结构中的肌纤维平均长度明显更高（两倍），这一点也通过偏移长度分布得到证实（图3D)。

图3 散装和 3D 生物打印结构的免疫荧光分析

2. 构造部分的分化和纤维排列分析
散装和生物打印结构都被快速冷冻以用于OCT铸造以获得冷冻切片。免疫荧光分析证实在两种情况下都存在结蛋白阳性和MyHC阳性肌纤维（图4A)）。细胞能够产生自己的细胞外基质(ECM)，纤维周围层粘连蛋白的存在证明了这一点，表明细胞已经成熟（图4A）。

细胞密度是一种指示切片内细胞存在和定位的测量值，在生物打印结构中显着更高，反映了肌纤维的更好分布，而在大块结构中，细胞主要位于最外层（图 4B）。此外，在生物打印条件下，在构造部分上测量的圆度和横截面积分别较高和较低，表明肌纤维沿构造纵轴的排列更好（图4C）；另一方面，大块结构显示出更大的横截面积但较低的圆度，正如预期的那样，肌纤维没有定向在一个单一的方向上（图4D）。

图4 结构截面分析

3. 小鼠生物打印结构植入后 TA 体积恢复
最后，作者采用VML小鼠模型评估打印系统在再生医学应用中的潜力。生物打印结构被植入物在宿主肌肉内整合30天。在对照小鼠中，TA 肌肉组织被消融，但没有被人工构造取代。与对照相比，植入的TA中的组织区域完全恢复，而对照则相反地显示组织恢复不良和不足（图5A）。大量LacZ阳性细胞核被标记在重建组织的中央有核肌纤维内，证明组织良好（图5B）。

图5 对消融和植入的小鼠TAs的免疫荧光分析

来自植入结构的重建组织被证明具有适当的血管化，如富含LacZ阳性细胞核的区域所突出显示平滑肌肌动蛋白(SMA)和血管性血友病因子(vWF)的阳性信号，分别标记血管肌肉壁和内皮细胞 (图6A）。此外，呈现 LacZ 阳性细胞核的重建肌纤维已被证明是受神经支配的，正如通过磷酸神经丝 (pNF) 和α-金环蛇毒素 (BTX) 免疫染色对神经突触前和突触后结构的阳性标记所证明的那样，证明在植入 3D 结构后，再生的TA肌肉内神经肌肉接头的发展（图6B）。在nLacZMabs重建的TA区域观察到Pax7阳性卫星细胞，表明重建了肌肉再生所需的干细胞生态位（图6C）。

图6 对3D生物打印结构中nLacZ-Mabs再生区域的更高放大倍数分析

4. 人体生物打印结构植入后TA体积恢复
为了评估将所提出的方法转化为人类研究的可能性，已经进行了利用肌肉来源的载有hMSC 的生物打印结构的试点实验。与上述实验类似，在50% TA肌肉消融后，将具有人类细胞的结构植入小鼠后肢。外植 TA 的横截面显示两个不同的区域，一个是宿主的天然肌肉，另一个是源自人类生物打印植入物的区域（图7A）。尽管与鼠源性植入物相比，异种移植物形成的组织总体上看起来组织性较，但与许多人Lamin A/C (Lam A/C)阳性细胞核共定位的大 MyHC 阳性区域表明重建的肌肉组织来自人类，并且hMSC能够生成与宿主消融TA整合的肌纤维（图7B）。

图7 植入载有hMSC的生物打印结构的小鼠TA横截面的免疫荧光分析

对重建的TA组织进行更深入的分析显示，具有横向小肌纤维的组织区域更多，这些区域在连续部分被证明是中央成核和 Lamin A/C阳性（图8A）。从人源性植入物重建的组织也显示出适当的血管化和神经支配，正如血管（SMA和vWF）和神经特异性（pNF和BTX）标记物所揭示的阳性信号所强调的那样（图 8B-C）。此外，在一些纤维的外围观察到Pax7阳性卫星细胞的存在，从而表明重建的TA具有再生潜力（图8D）。

图8 对源自人类细胞的重建 TA 区域进行更高放大倍数分析

在这项工作中，所提出的基于PF的无藻酸盐挤出3D生物打印系统建立在仅使用PF作为构成细胞支架的水凝胶的基础上，被证明是骨骼肌组织工程的一种新颖且具有竞争力的工具。所呈现的结果突出了这种创新印刷方法在两个主要方面的潜力：一方面，获得体外生物替代品的可能性显示出能够自发收缩的适当组织的肌纤维，这可以代表药物筛选和肌病研究的生物平台；另一方面，印刷结构在小鼠模型中恢复 VML 损伤的功效，包括小鼠和人源性肌源性祖细胞，表明所提出的方法可以代表再生医学的显着且有效的工具。

文章来源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb573