本帖最后由 SunPBiotech 于 2023-5-16 11:53 编辑
背景介绍 生物3D打印允许将细胞精确地沉积在模仿天然组织的复杂和不规则形状的结构体中。此前，人类角膜基质模拟结构已经通过基于挤出的打印技术、激光辅助的生物3D打印技术和立体光刻进行了生物3D打印。虽然生物3D打印在制造角膜模拟结构方面具有巨大的潜力，但是目前的技术方法仅仅集中在忽视角膜微结构的3D 宏观形状上。
以点击化学为基础的水凝胶是自发形成的混合反应化合物，这些反应是快速的、自发的、多功能的和极具选择性的。通常，叠氮炔环加成反应、 Diels-Alder 反应和巯基烯化学由于反应组分和原子经济性反应产物的双正交性而被称为点击化学。然而，这些方法并不适用于制造生物墨水与活细胞的3D 打印，因为他们需要严格的反应条件，有毒催化剂或高温。腙交联是由双正交官能团，即醛基和肼基之间的动态共价偶联形成的一种快速有效的伪点击反应。以 HA 为基础的腙交联水凝胶已经被研究用于模拟角膜结构的组织工程。然而，HA 基水凝胶的腙交联的凝胶时间很快(< 30s) ，导致生物制备窗口狭窄，因此这些水凝胶不能用作生物3D打印的生物墨水。因此，基于化学点击的水凝胶如何提供理想的生物制造窗口、高分辨率和细胞活力的新型生物墨水是基于挤出的生物3D打印的迫切需要。这种生物墨水可以使用动态共价化学来制备，这种化学是快速和有效的，不需要任何催化剂或光源。 研究开发了一种基于 HA 的生物墨水，可以用于人类角膜基质仿生结构的生物3D打印。所开发的水凝胶满足下一代生物墨水的要求，包括优异的打印性，形状保真度以及与人脂肪干细胞(hASC) ，hASC 衍生的角膜基质细胞(hASC-CSKs)和 hPSC- 神经元的细胞相容性。此外，研究还探索了几种用于角膜基质生成的生物3D打印策略，并分析了所得到的基质仿生结构的微观结构。研究通过在猪角膜器官培养模型中验证生物3D打印角膜基质的组织整合。最后，为了证明所开发的生物墨水和生物3D打印的角膜基质的实用性，研究探索了对打印角膜基质的神经支配，并制作了具有神经支配的第一个生物3D打印的角膜基质组织模型。
本研究合成了四种生物墨水组分：①多巴胺与透明质酸(HA-DA)的接枝；②利用碳二酰亚胺偶联化学进行碳二酰肼(CDH)与透明质酸(HA-CDH)的缀合；③多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA-CDH)上接合 CDH；④HA-醛(HA-Ald)的合成。使用两种 HA 基腙交联生物墨水，以评估共轭多巴胺对生物墨水特性的影响。第一种生物墨水含有 HA-CDH 和 HA-Ald 作为交联组分(HA 生物油墨)和另一种 HA-DA-CDH 和 HA-Ald (HA-DA 生物油墨)。用紫外-可见分光光度法在标准曲线的线性部分画出最佳拟合线，测定 HA-DA 对透明质酸双糖重复单位的多巴胺功能化程度为4.5 mol%。DA 显示出与文献一致的以下特征峰: 3345cm-1(胺 N-H 拉伸) ，3039cm-1(芳香族 O-H 拉伸) ，2946cm-1(烷基 C-H 拉伸) ，1614cm-1(胺 N-H 弯曲) ，1493cm-1(芳香族 C = C 拉伸)和650-1300cm-1区域中由于脂肪链的几个峰。HA 和 HA-DA 都在3100 ~ 3600cm-1处出现宽峰，这是由于 -OH 基团和胺N-H 基团的伸缩振动所致。研究还观察到，由于透明质酸骨架中的 C-O-C 半缩醛糖单位，在1033-1152cm-1附近出现峰值。HA 和 HA-DA 中还存在羧酸盐在1375-1405cm-1附近的不对称伸缩振动，-CH2基团在2895cm-1附近的对称伸缩振动，酰胺 I 和 II 在1550-1561cm-1附近的条带。在 HA-DA 的情况下，由于 DA 与 HA 的羧基结合，在1645cm-1和1733cm-1处出现独特的 C = O 和酰胺拉伸。
通过打印双层网格评价了 HA 基生物墨水的可打印性。HA 生物墨水在打印时没有形成长丝(图1(f)) ，表现为流体状，并且在打印过程中未能维持打印网格结构。相比之下，HA-DA 生物墨水显示出良好的长丝形成与和清晰的网格结构。在这里，一个90分钟的生物制造窗口获得 HA-DA 生物墨水打印。随后，研究进一步分析了 HA-DA 生物墨水的形状保真度，打印六层后立即测量334 ± 58μm 的网格线厚度(图1(g))。在培养的7天内，只有363 ± 77μm 的轻微增加。打印后立即获得0.95 ± 0.04的 PR，培养7天后仅略有下降至0.92 ± 0.02(图1(h))。经过七天的培养，打印的格子结构是均匀的，清晰可见的网格结构和开放的孔(图1(i))。 图1. HA-DA 生物油墨可支持高精度打印，具有良好的形状保真度和自愈合性能。(a) HA-DA 和 HA 生物油墨在连续流动下的剪切变稀。(b) HA-DA 和(c) HA 生物油墨在循环应变下的剪切变稀。(c)完全交联(d) HA-DA 生物油墨和(e) HA 生物油墨的应变回收率。(f)具有两个不同印刷参数的 HA 和 HA-DA 生物油墨的可打印性。比例尺5毫米。(g)纤维厚度和(h)孔隙因子评估印刷 HA-DA 生物油墨结构的形状保真度。(i)打印后和培养七天的印刷格子图像。比例尺5毫米。(j)三维生物打印结构的储存模量，表明培养结构的稳定性。(k)印刷结构随时间的降解和膨胀行为。(l) HA-DA 生物油墨的透过率。(m) HA-DA 生物油墨在定量机械压缩试验中表现出组织自愈合特性。
为了探究 HA-DA 生物墨水的细胞相容性，研究将生物3D打印的 hASC 和 hASC-CSK 分成二维培养和三维培养。研究在打印一天和七天后评估细胞的活力，两组细胞均有 > 95% 的高细胞活力(图2(a))。死亡细胞的数量在培养时没有增加。与 hASC-CSK 相比，hASC 在打印过程中的存活率略高(图2(a))。免疫荧光(IF)染色和 PrestoBlueTM 分析进一步验证细胞相容性。用鬼笔环肽对打印线条进行免疫荧光染色，发现1天后两种细胞类型的细胞形态均拉长(图2(b))。直到第7天，hASC 检测到细胞数量明显增加，在此期间，它们仍然按照原来的打印模式保持对齐。在第1天和第3天，hASC-CSK 的数量略有增加，然而此后没有明显的细胞增殖。两种细胞在打印后均表达增殖标志物 Ki67。与第1天和第3天相比，第7天在两个层状细胞系和三维基质结构中 hASCs 显示出更高的细胞增殖(p < 0.001)。另外，hASC-CSK 表现出强烈的 lumican 表达(图2(e))。为了进一步评估打印基质结构中的组织形成，研究在打印14天后对3D 基质结构进行了共聚焦成像。检测到两种细胞类型的缝隙连接蛋白连接蛋白43(Cx43)的阳性染色，表明在打印结构中形成细胞-细胞相互作用(图2(f))。在两种细胞类型的三维共聚焦图像中也可以看到细胞形态和细胞网络(图2(g)-(h))。
图2. HA-DA 生物墨水与 hASC 及 hASC-CSK 的细胞相容性研究。(a)打印后7天(活细胞 = 绿色，死细胞 = 红色) ，以线性结构和3D 结构打印的细胞存活率。(b)打印后一天，三天和七天打印行中 hASC 和 hASC-CSK 的细胞骨架(鬼笔环肽 = 红色)和增殖细胞(Ki67 = 绿色)。比例尺500微米。用 PrestoBlueTM (* * = p < 0.001)分析打印1,3和7天后，以线性结构(c)和3D 结构(d)打印的 hASC 和 hASC-CSK 的细胞增殖。(e)打印品打印7天后的细胞形态、增殖和角膜基质标记物表达。增殖细胞对 Ki67(绿色)染色，鬼笔环肽(红色)显示细胞形态，Lumican (紫色)检测角膜基质标记物表达。比例尺200微米。(f)打印后14天后生物3D打印基质中细胞-细胞相互作用的共聚焦图像。用鬼笔环肽(红色)观察细胞骨架，用间隙连接蛋白 Cx43(绿色)观察细胞-细胞相互作用。(g)打印14天后细胞在3D 结构中的3D 旋转共焦图像。(h)来自三维旋转共焦图像的生物3D打印结构的侧面图。比例尺100μm。 应用HA-DA生物墨水实现角膜基质结构的生物3D打印 接下来，研究探讨了三种不同的角膜基质组织工程打印策略，并探讨了打印结构体在培养上的相似性。将未分化的 hASC 在生物打印后也被打印并保存在它们的增殖培养基中。在预分化打印方法中，hASC 在打印前被预分化为 CSK。在打印后诱导分化方法中，通过将打印结构置于 CSK 分化培养基中，在打印印后开始 hASC 向 CSK 的分化。以上三种打印策略的生物3D打印结构表明，当用 HE 染色检查横截面时，hASC 和 hASC-CSK 均在整个3D 结构中稀疏地分布(图3(a)和(b))。hASCs 在整个打印结构中呈拉长的细胞形态，打印前分化 hASC-CSK 的方法也可以观察到类似的形态。相比之下，在打印后分化的 hASC-CSK 的横截面上看到的延伸率要小得多(图3(a)和(b))。在不同打印策略的培养过程中，细胞形态有很大的差异(图3(c))。在打印结构中，hASCs 呈细长的细胞形态和致密的细胞网络，而分化的 hASC-CSK 均表现出较多的树突状细胞形态，细胞体呈圆形，细胞外延较少。所有的打印方法中均可以观察到针对细胞-细胞相互作用的Cx43染色阳性 (图3(d))。细胞-细胞相互作用的数量在打印后分化组别中最高。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]波形蛋白是一种主要的结构性中间纤维蛋白，在正常的 CSK 中低水平表达。在 IF 染色的打印前和打印后分化方法中，hASC-CSK 均检测到波形蛋白的低表达(图3(d)) ，而 hASC 中没有表达。与生物3D打印的 hASC 相比，打印前分化的 hASC-CSK 检测到 VIM 表达增加(p < 0.05)。相反，在 IF 染色中，hASC 显示 α-SMA 的阳性表达，而在打印前和打印后分化的 hASC-CSK 中很少或没有表达 α-SMA。Lumican 是富含亮氨酸的小蛋白多糖家族的成员，也是角膜基质中发现的主要 KS 蛋白多糖。在这里通过共聚焦最大密度投影图像(图3(e))和具有纤维组织和密度的组织切片的 IF 染色(图3(f))显示的打印前分化策略中，在用 hASC-CSK 制备的打印结构中检测到最高的 lumican 表达。在 qPCR 分析中，与2D中的未分化 hASC (p < 0.001)和3D 打印的 hASC (p < 0.01)(图3(g)) 相比，打印前和打印后分化的方法均显示 LUM 表达增加。然而，与作为阳性对照的 hCSK 相比，hASC-CSK 中 LUM 和 VIM 的表达较低(p < 0.001)。这些数据表明，这两种打印策略已经使结构中的 hASC 向角膜角质细胞谱系的分化开启。在打印14天后的打印结构照片(图3(h))中可以检测到带有 hASC 的打印结构的不透明度增加。相比之下，用打印前和打印后分化的方法所构建的样品显示出透明的结构。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3. 人眼角膜基质结构的生物3D打印方案。(a)打印 hASC 21天后冷冻切片的 HE 染色，打印前分化的 hASC-CSK 和打印后分化的 hASC-CSK。比例尺500微米。(b)细胞分布，形态和取向。比例尺200微米。(c)波形蛋白(紫色) ，Cx43(绿色)和 α-SMA (红色)(d)和 lumican (红色)(e)的共焦最大密度投影。比例尺100微米。(f)在打印21天后从冷冻切片显现的 Lumican (紫色)表达。比例尺200微米。(g) LUM 和 VIM 的 qPCR 分析(* = p < 0.05，* * = p < 0.001)。hCSK 作为对照。培养14d 后生物3D打印角膜基质结构的透明度(h)。用 Hoeschst 33342(蓝色)显示细胞核。 [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] 生物3D打印角膜基质结构与宿主组织的整合
在探索了用 HA-DA 生物墨水生物3D打印人类角膜基质的可能性之后，研究接下来评估了打印的角膜基质结构体植入体内角膜缺损模型后的性能。根据前述实验结果，选择了打印前分化的构建策略。研究对切除角膜的猪进行了前板层角膜移植手术，将生物3D打印的角膜基质移植到伤口部位。培养21天后，采用 HE 染色和 IF 染色，观察打印结构与宿主角膜的整合情况。植入的生物3D打印角膜基质结构在培养期间没有额外固定的情况下可以保持在原位。21天后，生物3D打印的角膜基质结构显示出与宿主角膜良好的附着和粘附(图4(c))。IF 染色显示打印结构中含有STEM121阳性细胞，即打印结构中仍然存在人类细胞。高倍图像(图4(g))表明，打印结构是紧密连接到基础宿主基质。此外，当检查植入结构和宿主角膜的界面(图4(h))时，在打印结构内观察到 STEM121阴性的细胞，表明猪细胞迁移到打印结构。此外，在顶端一侧，宿主猪上皮已经在生物3D打印的角膜结构上生长(图4(i))。猪角膜上皮覆盖了 STEM121阳性的含有打印基质结构的人类细胞(图4(j))。最后，在离体培养物的打印结构中也检测到 lumican 的少量表达(图4(k))。
图4. 在猪体内培养21天后的生物3D打印角膜基质结构。(a)将生物3D打印结构植入 Barron 人工前房中，(b)植入生物3D打印仿生基质结构的猪眼球，(c)生物3D打印角膜基质仿生结构的体内培养后的 HE 染色，(d)中央人类角膜基质，比例尺200μm，(e)用人细胞特异性标记 STEM121(绿色)和鬼笔环肽(红色)分析生物3D打印的角膜基质与宿主整合的情况。(f)将人角膜基质作为对照。比例尺500微米。(g)来自 HE 和(H) IF 染色的生物3D打印结构与素质猪基质之间界面的高倍放大图像。STEM121(绿色)阴性的细胞出现在打印结构中(白色 *) ，表明宿主细胞与打印的基质结构整合。(i) HE 染色和(j) IF 染色的生物3D打印表层结构的高倍图像。(k)体内培养的生物3D打印结构中角膜基质标记物 Lumican (红色)的表达。(1)以人眼角膜为对照。比例尺100μm ((g)-(l))的细胞核用 Hoechst 33342(蓝色)显示。
生物3D打印角膜基质的神经长入和支配
采用 LIVE/DEAD 方法研究了hPSC-神经元与 HA-DA 生物墨水的细胞相容性。神经元表现出良好的生存能力。大多数细胞在打印1天后仍然存活，并且在打印7天后观察到死亡细胞的数量减少(图5(a))。水凝胶中的细胞表达神经元标志物 βIII-tube 和 MAP。打印1天后，神经元显示出短的神经突生长，并且在打印7天后形成长轴突的清晰的神经元网络(图5(b))。在两个时间点均检测到细胞增殖标记物的暴打(Ki67阳性)，但7天后阳性细胞的数量减少(图5(c))。上述发现表明 HA-DA 生物墨水与 hPSC 来源的神经元细胞具有良好的细胞相容性。通过将神经元细胞打印到结构的外围，成功地将神经支配加入到生物3D打印的基质仿生结构中(图5(d))。对于没有靶细胞的对照组(图5(d) i)或以 hASC-CSK 作为靶细胞的打印结构(图5(d) ii) ，研究打印基质仿生结构的神经支配发展。无靶细胞的样品培养21天，以 hASC-CSK 为靶细胞的样品培养14天。在两组中，随着时间的推移都检测到向中央角膜方向的长突生长(图5(e)和(f))。然而，在以 hASC-CSK 为靶细胞的样品中，神经支配似乎发展得更快、更早。培养7天后的含 hASC-CSK 的3D 角膜结构的中心部分已经可以看到表达 NFH 的长轴突，而在对照组中，直到培养14天，在没有靶细胞的生物墨水中不能看到轴突。对照组培养21天后轴突生长情况与对照组相似。在共培养组中，在 hASC-CSK 之间生长的轴突在打印14天后形成了几个轴突的束(图5(f))。
图5.受神经支配的生物3D打印角膜基质仿生结构。(a)生物墨水中的神经细胞在打印一天和七天后的活性(活细胞 = 绿色，死细胞 = 红色)。(b)打印后1天和7天，在打印行中细胞的神经元标志物 βIII 桶(红色)和 MAP2(绿色)的表达。(c)增殖标记 Ki67(洋红色)在打印行后1天和7天的阳性染色。(d).实验组的示意图: 生物3D打印角膜基质仿生结构，其中神经元细胞被生物打印到角膜的外围(位置突出显示紫色方块)。中央部分为(i) 没有细胞的生物墨水 (对照)或(ii)含hASC-CSK的生物墨水(位置突出显示在黄色方块)。在对照组和以 hASC-CSKs 作为神经元中心靶细胞组别中观察随时间发展的神经支配表达物(e) NFH (绿色)和(f)鬼笔环肽(洋红色)的 hASC-CSKs 染色。比例尺为100微米。
结论和展望 研究开发了一种基于 HA 的生物墨水，使用动态共价化学，以满足下一代生物墨水的要求，具有优异的打印适性，稳定性，细胞相容性以及打印后不使用光交联的优点。HA-DA 生物墨水具有良好的力学性能和自愈合性能。同时研究证明了开发的生物墨水使用临床潜在的人类干细胞完成人类角膜基质仿生结构生物3D打印的可行性。生物3D打印的角膜基质仿生结构能够良好的与宿主组织整合。研究制造了第一个具有神经支配的生物3D打印角膜组织模型，证明了开发的生物墨水和打印的人类干细胞来源的角膜基质仿生结构在未来的各种角膜组织工程应用中具有巨大的潜力。
参考文献 Mörö A, Samanta S, Honkamäki L, et al. Hyaluronic acid based next generation bioink for 3D bioprinting of human stem cell derived corneal stromal model with innervation[J]. Biofabrication, 2022, 15(1): 015020.
https://doi.org/10.1126/10.1088/1758-5090/acab34
参考文献 [color=rgba(0,]https://doi.org/10.1126/10.1088/1758-5090/acab34
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