3D打印可被超声激振的生物支架加速骨再生

来源： EFL生物3D打印与生物制造

物理刺激对细胞培养的应用显示出调节多种细胞功能的潜力，包括迁移、分化和存活。然而，这些体外模型在体内外实际的应用潜力取决于物理刺激是否可以外用，而无需侵入性的刺激手段。针对这一要求，荷兰马斯特里赫特大学梅林技术启发再生医学研究所的Lorenzo Moroni教授团队提出了一种3D打印的动态双面支架，该支架可用外部超声波激活纳米振动，并传递到周围的细胞，调控细胞功能性表达，从而实现骨再生，相关工作“Janus 3D printed dynamic scaffolds for nanovibration-driven bone regeneration” 发表在Nature Communication杂志上。研究人员调控可生物降解的聚己内酯（PCL）和聚乳酸（PLA）共混物中的相对比例，通过相分离自发形成双面结构（图1），利用3D打印技术制备所需宏观三维结构，由于PCL和PLA不同的生物相容性和声学响应性分别作为背衬材料和活性材料，从而形成一个超声换能器（超声到机械振动）。这样就可以实现非接触式物理刺激的感应与传递，将超声的声频转变为支架的机械挠度形变，从而影响细胞增殖、分化以及蛋白表达等行为。该研究发现，经超声刺激的支架表面的细胞表现出更显著的成骨分化，具有更高的成骨标志物表达和更高的基质蛋白I型胶原和纤维连接蛋白沉积。另外，研究人员还发现这种分化增强与细胞上的电位门控钙离子通道的形成增强以及进一步激活有关。

图1 双面结构的3D打印制备过程

在支架的制备过程中，研究人员首先选择了两种广泛使用的可生物降解和生物相容性的聚合物--聚已内酯(PCL)和聚乳酸(PLA)，按照一定的比例将其混合制成纤维状颗粒，再通过熔融沉积3D打印的方式，将材料挤出打印成支架结构。由于PCL和PLA之间没有良好的相互作用，因此他们不互溶，形成分离的两相，该过程出于材料本身的性质，故能自发形成。通过调节PCL和PLA的相对比例，研究人员发现，当PCL和PLA以1：1的比例混合时，打印的支架结构纤维内部可以看到明显的相分离界面，两相可以较为清楚和独立地分开，如图1b所示。

为了使打印的支架双面结构化身为可超声激活的动态机械支架，研究人员选择了不同频率的超声波来评估不同组分（Janus，PCL，PLA）支架的最佳偏转，以触发细胞反应，如图2所示。结果显示，声波的偏转在较高声频和较软的材料下减弱，PCL相较PLA质地更软。而单独分析这些材料时，较低的偏转振幅(较高的频率)导致了相对于未受刺激培养的更高的增殖。

图2 超声波远程驱动支架结构的微纳振动以及对细胞行为的影响

为了评估外部超声刺激3D打印支架实现骨再生的潜力，我们在Janus、PCL和PLA支架上培养hBMSCs 21天，在成骨培养基中，静态(0 kHz)和刺激(40 kHz, 30分钟/天)条件下。培养21天后，在受刺激的Janus支架上形成致密的I型胶原网络(图3a)，而受刺激的PCL、PLA或任何静态培养条件只显示细胞内表达。与刺激PLA或任何静态条件相比，在受刺激的Janus和PCL材料上培养的细胞上，在基因水平上也检测到了I型胶原、RunX2和骨钙素的上调(图3b)，而在Janus支架上的上调更为明显。此外，Janus支架上沉积的矿物呈圆形多孔形态，这通常属于无定形羟基磷灰石或磷酸钙。在骨矿化过程中，无定形和球形的磷酸钙矿化形成碳酸化羟基磷灰石，这表明Janus支架具有骨形成潜能（图3d）。ATP释放是机械刺激下成骨细胞反应的关键调节因子，在受刺激的Janus支架上培养的hBMSCs比其他任何受刺激或静态条件下培养的hBMSCs高4倍。在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中，在2D间充质干细胞培养过程中，在直接低强度超声刺激下，ATP释放增加，并导致细胞膜去极化，这与我们在这里观察到的结果一致(图3)。

图3 Janus支架在远程超声刺激下促进hBMSCs成骨分化

细胞膜去极化，作为机械刺激的结果，导致电位门控钙离子通道(VGCC)的激活，以调节钙流入细胞。为了确定L-VGCCs是否参与成骨分化，我们评估了编码L-VGCC亚基Cav1.2的CACNA1c基因的表达;我们发现CACNA 1c在受刺激的Janus支架上上调了3倍，而在受刺激的PCL或PLA支架上则没有上调(图4a)。在分化过程中，用硝苯地平阻断L-VGCC，发现材料和培养条件下都导致细胞数量减少，但在刺激条件下更明显。阻断L-VGCC还导致I型胶原、RunX2和骨钙素基因表达下调，导致刺激和静态培养条件下无显著差异(图5d)。因此，当LVGCC被阻断时，超声刺激不再影响细胞的分化或增殖，证明了二者的直接相关性。

综上，该研究提出了一种外部超声波远程控制支架动态振动以诱导细胞行为的方案，PCL和PLA支架分别以阻尼材料和偏转材料的形式响应超声，而这两种材料的组合将导致更短的脉冲宽度和更小的偏转。Janus支架的刺激会增加hBMSCs的细胞增殖，以及成骨标志物的表达和沉积。因此，远程激活Janus支架是传统静态植入的理想选择，可以提供细胞的指令刺激，该研究展示了体外模型在植入体内接受外部刺激的应用潜力。

文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41467-021-21325-x