3D打印载表面功能结构的坚韧水凝胶支架用于组织再生

来源： EFL生物3D打印与生物制造

体内很多组织主要成分是蛋白类有机材料，有着很好的强度和韧性。在组织再生修复中常用的生物水凝胶也是以从天然组织中提取的明胶等为作为主要成分，但其在提取及工程化处理后，生物学性能很大程度上保留下来，强度和韧性却丧失了。故而目前的生物水凝胶及打印的水凝胶支架大多软脆，力学性能不佳。那能否在体外恢复出类体内的强度和韧性？

EFL团队在2023年报道了一种机械训练方法，将明胶基水凝胶的强度提升了145倍。但该工作的局限性在于，该方法无法与3D打印集成，难以实现有序的三维结构。本研究提出了一种通用的坚韧水凝胶支架制造方法(打印-P、训练-T、交联-C)来填补这一空白。通过3D打印制备定制化结构、光交联锁定强化训练结果，将水凝胶支架的强度提升622倍，进一步的我们制备出具有3D打印定制化多孔载表面功能结构的坚韧水凝胶支架，并进行了系列体内植入实验证实了其有效性。

我们首先通过3D打印制造出具有所需结构的水凝胶支架(P)。然后，通过盐析辅助的循环机械训练(T)，支架可以具有极高的机械性能和功能表面结构。最后，通过光交联处理(C)固定训练结果。获得的坚韧明胶水凝胶支架具有优异的抗拉强度，在保证优异生物学性能的同时，强度可达6.66 MPa(是未经处理的622倍)。

该支架具有从纳米到微米到毫米的功能表面结构，可以有效地诱导细胞定向生长，该方法还能通过支架力学性能的调控，实现对10 kPa-10 MPa人体组织的仿生。我们还证明了这是一个通用的策略，许多生物水凝胶，如明胶和丝素蛋白，都可以通过该策略提升强度。我们通过动物实验证明这个强韧的水凝胶体系有极佳的生物学性能，能促进缺损组织的快速再生。

相关研究以“3D Printing of Tough Hydrogel Scaffolds with Functional Surface Structures for Tissue Regeneration”为题发表在《Nano-Micro Letters》。浙江大学的贺永教授和浙江大学口腔医院的谢志坚教授为论文共同通讯作者，共同第一作者为姚克博士和洪高英博士。

图1 坚韧水凝胶支架的制备方法及特点

研究者首先通过3D打印制备具有多孔和定制结构的水凝胶支架，随后在训练中，将水凝胶放在硫酸铵溶液中反复拉伸。通过盐析进行相分离，硫酸铵取代水分子的位置，在水凝胶支架表面和内部形成定向微观结构，促进水凝胶分子链有序排列。然后将水凝胶置于PBS溶液中释放预拉伸，并从水凝胶中释放硫酸铵，以确保水凝胶支架的生物相容性。经过几轮训练，研究者构建了具有功能表面结构的强韧的水凝胶支架。

图2 坚韧水凝胶制备过程示意图及性能

进一步，研究者研究了水凝胶支架在硫酸铵溶液中拉伸训练时的强化机制。带电残基之间的相互作用可以提供特异性。在训练过程中，水凝胶分子链的结合顺序与结合物质的电荷强度有关。硫酸铵离子强度最高，首先与亲水分子链结合。因此，在拉伸训练过程中，由于结合能低于配位的强化结合能，H2O被SO42−配位强化。随着拉伸过程的继续，分子链在拉伸应力的作用下变得更加紧密，并沿拉伸方向定向。当SO42−的配位能高于水分子的配位能时，原来与分子链结合的水分子会被SO42−所取代。由于离子强度和结合能的变化，水分子逐渐从GelMA分子链上解离(图3i)，使其密度增大，实现了水凝胶支架的强化过程。研究者通过分子动力学进一步验证了上述观点。综上所述，高取向度分子链与致密的分子链网络协同显著增强了水凝胶支架的力学性能。

图3 坚韧水凝胶支架强化机理

接下来研究者发现，在水凝胶支架的训练过程中，不同的拉伸比例会影响训练效果。在拉伸开始时，随着拉伸比的增大，分子链沿拉伸方向排列的效果更加明显，强化效果也更加明显。但是，如果拉伸比过大，水凝胶纤维可能会断裂，导致微观结构缺陷，进而影响水凝胶支架的力学性能。最终研究者确定100%为最佳拉伸比例（图4）。随后研究者验证了坚韧水凝胶支架能够显著延长其降解时间，能够匹配组织修复时长。且通过训练后，几乎不含硫酸盐组分，保证了其生物相容性。

图4 坚韧水凝胶支架的可打印性及拉伸比例的影响

有趣的是，该策略可以通过改变盐的类型产生机械性能为10 kPa-10 MPa的仿生人体组织力学性能的坚韧水凝胶支架，并且许多水凝胶，如明胶和丝素蛋白水凝胶，可以通过这个策略得到改善，显著提升其力学强度或断裂延展性。

图5 坚韧水凝胶力学性能可调

细胞实验表明，坚韧水凝胶支架不仅具有良好的生物相容性，并且能够显著促进细胞黏附。并且在4天内可有效诱导C2C12细胞定向生长。

图6 坚韧水凝胶支架的生物相容性

动物实验表明，该支架能在4周内有效促进新一代肌纤维、血管和神经的生成，促进大容量肌肉损失损伤的快速再生。

图7 术后2周和4周各组再生肌肉组织学分析

图8 术后2周和4周各组再生肌肉的免疫组织化学分析

文章来源：
https://link.springer.com/article/10.1007/s40820-024-01524-z