来源： EFL生物3D打印与生物制造
3D打印（3DP）水凝胶基血管构建物已经作为对受损血管或器官功能的一种响应而得到研究，通过精确复制3D结构几何形状以接近其功能。然而，它们仍然面临固有的脆弱性挑战，这无法承受缝合线的穿刺，并且在与血液直接接触时无法保持长期结构和功能稳定性。
来自华南理工大学的施雪涛等团队报告了使用基于聚乙烯醇（PVA）的墨水进行高保真数字光处理（DLP）3D打印水凝胶基血管构建物，随后通过工程化纳米晶体域和后续表面修饰来增强机械强度。所制备的高精度水凝胶血管构建物被赋予了高度期望的机械强度、缝合耐受性、抗膨胀性、抗血栓性和长期通畅性。值得注意的是，具有精确瓣膜结构的水凝胶基仿生静脉移植物在控制单向流动方面表现出色，并在4周内植入比格犬深静脉中成功实现了生物学功能和通畅性，从而证实了其在治疗慢性静脉功能不全方面的有希望的潜力。相关工作以题为“3D-Printed Hydrogels with Engineered Nanocrystalline Domains as Functional Vascular Constructs”的文章发表在2024年09月04日的期刊《ACS Nano》。
1.创新型研究内容
聚乙烯醇（PVA）具有规则结构和灵活的分子链，使得可以通过结晶来定制PVA水凝胶的力学性能。此外，羟基的易于功能化，加上其出色的生物相容性和血液相容性，使其成为制造具有所需性能的血管构建物的理想材料。本文报告了通过DLP 3D打印大分子前体油墨来制造水凝胶基血管构建物的方法，该油墨由缩水甘油甲基丙烯酸酯功能化PVA（PVAGMA）组成，随后用碱溶液处理以工程化纳米晶体域，从而产生具有精细三维结构、优异韧性、机械强度、抗膨胀性和缝合耐受性的3DP水凝胶构建物（图1a）。根据制备步骤，本文将它们命名为碱处理光固化PVA（AP-PVA）水凝胶。通过用生物活性模式（如含有Arg-Gly-Asp（RGD）肽的明胶）功能化水凝胶表面，AP-PVA水凝胶基构建物被赋予了显著改善的内皮化潜力，因此在体内血液相容性。这一系列出色的性能之前尚未在同一系统的3DP水凝胶材料中同时报道过（图1b,c）。此外，本文的方法能够构建各种结构复杂的可植入血管构建物，如多分支移植物和小尺寸血管网络等。通常，所制备的仿生瓣膜静脉移植物（BVVGs）拥有与天然静脉瓣膜相当的结构和功能的瓣膜，可以进一步用于替换功能受损的深静脉（图1d）。本文创建水凝胶血管构建物的方法可以根据不同的临床需求进行定制，可能会为有效的血管功能修复解决方案的持续发展做出贡献。
图1 纳米晶体工程化的3D打印水凝胶用于构建结构复杂的血管构建物
通过纳米晶体域工程实现机械强度的3D打印PVA基水凝胶
图1a展示了制备具有纳米晶体域工程的3DP水凝胶（即AP-PVA水凝胶）的过程。为了使PVA链可光交联以用于DLP 3D打印，首先通过与缩水甘油甲基丙烯酸酯的化学反应将聚合物链功能化。可以容易获得具有不同分子量（Mw）和取代度（DOS）的PVAGMA。对于相同的Mw（75 kDa）的PVA，低DOS（例如0.35%）可能导致机械性能弱的P-PVA水凝胶，这些水凝胶在3D打印过程中无法支撑结构。过度的化学交联（例如DOS为0.8%）可能限制链的移动性和规律性，这也不适合后续的晶体域工程。另一方面，增加分子量可以促进在较低的交联比率下进行凝胶化和随后的结晶；然而，这可能伴随着不利的打印因素，如粘度升高（图2a）。最终，优化了用于DLP 3D打印的PVAGMA油墨水溶液，其Mw为75 kDa，DOS为0.5%，浓度为9 wt%，同时使用5 mg/mL的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂（LAP）作为光引发剂，1.0 mg/mL酒石黄作为光吸收剂（图2a）。可以容易地制造出具有高结构保真度的3DP水凝胶构建物，而后续的纳米晶体域工程可以有效地调整力学性能（图2b）。
为了探索一种合适的策略来诱导结晶，本文采用了不同的方法，如冻融法、干式退火、盐析法和碱处理（即15 wt% NaOH溶液浸泡），以增强3DP水凝胶构建物的强度。评估了水凝胶的相应三维尺寸变化和机械性能（图2b、c）。尽管干式退火样品表现出稍高的强度，但不均匀的脱水过程导致尺寸收缩不一致和显著的结构变形。与之形成鲜明对比的是，对于冻融和盐析处理，很难诱导稳定且足够高的结晶度，因此无法实质性地增强3DP水凝胶构建物的强度。值得注意的是，碱处理在确保体积收缩一致的同时显著提高了机械性能（图2c）。
图2 具有机械强度的AP-PVA水凝胶构建物的3D打印
3D打印基于水凝胶的功能血管构建物
基于本文优化的制造工艺和机械强化策略，可以制造出具有复杂3D几何形状的血管构建物。本文最初使用AP-PVA水凝胶在心脏中构建了一个多分叉的主动脉弓结构，并开发了一个带有三尖瓣的主动脉瓣结构，初步证明了其在防止反向流体流动方面的有效性（图3a）。此外，人体内的小血管结构复杂，相应的移植物难以制备。本文成功地制造了一个内径为0.75毫米的血管结构，该结构保持密封，灌注过程中未观察到液体泄漏（图3b）。这些成就凸显了本文的方法在定制血管移植物的形状和大小方面的优势。一些更复杂的血管系统，如肺血管系统，具有复杂的血管气管多尺度拓扑结构，模仿和重建其结构以实现类似功能仍然很困难。通过调整其外部配置，本文将最小表面结构的内部通道分为独立的和相互交织的两相空间。这两个空间之间的巨大表面接触促进了气体-血液相互作用，这对于构建功能性人工肺结构至关重要。通过向两个相邻通道注入氧气和水，本文观察到输出水中溶解氧从6.55 mg/L增加到6.75 mg/L，减慢注水速度进一步提高了水中的溶解氧水平（图3c）。此外，通过调整其细胞大小，本文设计的结构可以增加接触面积，在1立方厘米的结构内达到高达15平方厘米的接触面积（对于9×9个细胞）。这使本文的结构在开发可植入式人工肺方面具有重要的潜力。
图3 3D打印基于水凝胶的功能血管构建物及其体外功能
水凝胶的表面改性与生物相容性
小型血管移植物在长期植入过程中容易形成血栓，导致血管移植物功能失效，尤其是对于存在瓣膜、血流较慢（约10 cm/s）的静脉移植物而言。（54）内皮细胞（EC）层存在于天然血管的内衬中，释放功能性物质以防止血栓形成并分解暂时形成的血栓。尽管已经开发了一些含有细胞的血管构建物，但由于伦理问题、免疫原性问题、长培养周期和通常不足的机械性能，它们的临床应用仍然有限。考虑到这些挑战，开发一种无细胞的血管构建物，在植入后能够在原位内皮化，是一种有前景的替代方案。细胞毒性测试表明，AP-PVA水凝胶具有优异的体外细胞相容性。PVA水凝胶本身就具有出色的低血栓形成性，但它们高度亲水且缺乏细胞粘附位点；因此，它们不能使EC粘附和扩散。用有利于细胞粘附的生物活性成分进行表面功能化，如含有Arg-Gly-Asp（RGD）肽的明胶，已被证明是促进细胞粘附的有效策略。由于涉及到碱处理过程，这些生物活性组分的结构被破坏，导致细胞粘附略有改善（图4b）。为了解决这一挑战，本文在碱处理后采用了表面修饰，即N,N′-碳二咪唑（CDI）介导的化学锚定（图4a）。FTIR光谱中酰胺部分的信号峰出现、接触角的表面亲水性变化以及与异硫氰酸荧光素（FITC）-明胶相对应的绿色荧光的出现共同证实了明胶成功嫁接到水凝胶构建物上。这种经修饰的水凝胶构建物简称为AP-PVA-G。EC的粘附显著改善，导致AP-PVA-G人造血管管内壁更加均匀地扩散（图4b、h）。此外，免疫荧光测定还表明，粘附在水凝胶表面的人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人类血管平滑肌细胞（HVSMCs）保留了它们的正常表型（图4f、g）。
图4 3DP水凝胶基构建物的表面功能化，提高了生物相容性
在小猎犬中用于深静脉置换的生物血管移植物
为验证本文的3DP水凝胶构建物作为人造血管移植物替代病变血管的潜力，通过端对端缝合在小猎犬中进行了后肢深静脉置换。小猎犬腿部的主要静脉血管与人体中的相似，包括股静脉、隐静脉和位于肌肉内的深静脉，而原生瓣膜则随机分布。通过术中X射线血管造影进行顺行和逆行静脉造影以评估瓣膜的功能（图5a、b）。顺行成像结果显示，在3DP水凝胶静脉植入后，造影剂成功通过了水凝胶静脉，表明血管保持通畅。逆行结果显示，由于植入前没有瓣膜，造影剂可以渗透到深静脉中，这并不意味着存在疾病，因为在这种情况下根本没有瓣膜。然而，在植入水凝胶血管后，造影剂的渗透受到限制，证明了瓣膜的功能（图5c）。此外，本文使用超声波成像监测3DP水凝胶血管的通畅性，在一个月的植入期间它保持通畅（图5e）。一个月植入后，小猎犬的血液分析结果保持正常。免疫荧光染色结果显示，粘附在BVVGs内部的细胞表达了平滑肌细胞（SMC）特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和内皮细胞（EC）特异性标志物冯·威尔布兰因子（VWF）。这表明在植入一个月后血管细胞的粘附和增殖，展示了在BVVGs上形成内皮化层的潜力（图5d）。这些发现初步证实了本文的3DP人造含瓣膜静脉用于长期深静脉置换的潜力。
图5 在比格犬深静脉中植入3DP水凝胶基BVVG（生物血管静脉移植物）
【总结与展望】
本文提出了一种策略，通过3D打印基于PVA（聚乙烯醇）的前体油墨来制造机械强度高的水凝胶基血管构建物，同时通过引入纳米晶体域可以显著增强其韧性和强度，从而满足血管构建物的要求，包括高保真度、结构复杂性、机械强度和血液相容性。体外和体内研究已经证明了其在功能性血管替代方面的有希望的应用，以及其有利的瓣膜结构能够精细调节内部流动，特别是在比格犬深静脉替换中使用含有3DP仿生瓣膜的静脉移植物的情况下。因此，本文的3DP水凝胶构建物在临床个性化血管移植和血管化器官构建研究中具有极大的前景。更一般地说，这种设计和制造平台提供了扩展创造各种人造组织和器官以供植入的可能性。
文章来源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c08359
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