来源： EFL生物3D打印与生物制造
大孔水凝胶在生物医学应用中显示出巨大的潜力，特别是在再生医学领域，这归功于它们增强的营养和废物渗透性、改善的细胞通透性和最小的免疫原性。然而，传统制造多孔水凝胶的方法需要二次后处理步骤或有害试剂，这使得与生物活性因子和细胞同时制造变得不可能。
来自美国康涅狄格大学健康中心的 Ali Tamayol等团队开发了一种手持打印机，用于方便且连续地生成和沉积水凝胶泡沫，直接在皮肤缺损处形成特定于缺陷的大孔支架。在该手持系统中，一个温度控制的微流控均质器与微型液体和空气泵相结合，以所需比例将无菌空气与明胶甲基丙烯酰基（GelMA）混合。然后利用集成的光交联单元在原地交联打印的泡沫，形成具有控制孔隙率的支架。该系统被优化以形成可靠且均匀的GelMA泡沫。所得泡沫支架展现出优异的机械性能和灵活性，使它们适用于伤口愈合应用。体外细胞培养结果显示，与实体水凝胶相比，支架上的细胞活性显著增加。体内打印的泡沫支架提高了小鼠全层伤口的愈合速度和质量，无需使用生物材料。相关工作以题为“Benefits of In Situ Foamed and Printed Porous Scaffolds in Wound Healing”的文章发表在2024年09月09日的期刊《Advanced Healthcare Materials》。
1.创新型研究内容
本文开发了一个系统，通过整合i) 一个温控的现场打印机，ii) 一个空气泵和iii) 一个微流体均质机，以同时生成并打印高度可控的多孔泡沫支架，用于治疗皮肤伤口（图1）。在这种方法中，GelMA水凝胶前体和空气分别通过线性执行挤压系统和空气泵，流入微流体均质机，在这里，气泡被引入GelMA流中并通过连续的气泡分裂实现均质化（图1A）。这种胶体乳液随后通过出口喷嘴，被现场打印到缺损部位，并随即与内置的光交联单元交联。多孔泡沫的即时打印和光交联阻止了气泡的不稳定性及合并。这种方法便于处理不规则形状的伤口以及曲面上的伤口，并且无缝形成大孔支架，这些支架能够适应并粘附于剩余组织上。泡沫的相互连接的大孔结构，如扫描电子显微镜（SEM）所显示的，改善了细胞浸润、增殖和组织重塑（图1A）。紧凑的设备（图1B）使其可以在资源有限的环境中作为手持式打印机使用，同时该设备也可以安装到自动控制系统上，如机械臂，以实现更精确、高分辨率的植入物输送。此外，本文的平台不依赖手动挤压，并允许进一步自动化。
手持式一步法泡沫打印机的发展
图1B展示了开发的一步法原位泡沫打印机。该系统由五个集成模块组成（水凝胶前体温度控制系统、电动水凝胶前体挤出系统、微型气泵、微流控均质器和光交联照明系统），这些模块被封装在一个外壳中，使整个系统成为一个紧凑的移动设备（图1C）。模块化设计便于快速简便地组装和拆卸打印机，以及迅速更换前体注射器盒。此外，系统的模块化还使得维护或修改变得简单，例如使用不同尺寸的前体注射器盒、不同类型的电机或任何未来的升级，而无需重新设计整个系统。组装好的设备体积小（主机箱尺寸：18 × 5 × 4厘米）且重量轻（278克），可以用一只手轻松操作和控制（图1B）。
图1 一步法原位打印大孔支架用于皮肤伤口组织再生
微流控均质器的设计及泡沫孔隙率优化
紧凑型微流控均质器被设计并制造出来，以便于水凝胶前体的一步式充气过程（图2A）。这些均质器通过组装三个部件制成：一个三通连接器、一个微网组件和用于连接的鲁尔锁接头。特别设计的三通连接器使用鲁尔锁接头进行快速连接；两个凸形鲁尔锁被用于水凝胶和空气输入，而一个下游凹形连接器被用于微网组件的附着（图2A）。空气通过一个包含三个通道的微流控混合器引入到水凝胶前体流中。本文的初步实验表明，这些通道比单通道设置更有效地引入并将空气混合入水凝胶流中，从而产生更均匀且质量更高的泡沫。第二个组件是微网组件，由多个尼龙微网组成，彼此间隔1毫米，用于顺序气泡分裂。在挤出含有大气泡的GelMA水凝胶前体通过微网组件时，水相轻松流过网格，而气泡经历剪切应力迫使它们顺序分裂，直到形成均匀细腻的GelMA泡沫为止（图2B）。这将在沉积和原位光交联后在支架中形成均匀的大孔。微网组件的配置，包括网孔大小和网层数量，决定了打印泡沫的孔隙率和孔径分布。通过改变进气压力和生物材料浓度、温度及前体挤出速率，可以进一步调节孔径和孔隙率。对孔隙结构的这种控制程度是非常宝贵的，也是这项工作相较于以往研究的主要优势之一。微流控均质器的最后一个组件是一个凹形鲁尔锁末端，用于快速连接到不同尺寸或形状的打印针头和喷嘴。
图2 微流控均质器的设计及参数优化使得能够生成具有可控孔径的多孔水凝胶
一步发泡和打印的演示
由于发泡过程的自动化以及对过程参数的控制，这一过程具有高度的重复性，并且能够很好地控制打印泡沫的孔隙率和孔径分布。该系统旨在用于手动打印，或者可以安装在机械臂上以实现大孔支架的全自动一步打印（图3）。紧凑的系统能够同时生成、打印和光交联多孔泡沫水凝胶支架。手持式系统被封装在一个符合人体工程学的外壳中，易于长时间握持和操作（图3A）。其小尺寸和轻重量使其成为外科医生在手术室或资源有限的环境中（如战场）使用的理想设备。操作者能够操纵喷嘴尖端覆盖非均匀几何形状和曲面上的伤口，无需增加医疗成像或扫描、计算处理或工具路径生成的复杂性。重要的是，它通过消除对额外固定的需要，解决了传统植入柔软水凝胶支架的挑战，因为在原位交联时支架会粘附在组织上。为了便于填充各种几何形状的缺损，本文利用了各种市售或定制设计的喷嘴几何形状（图3B）。本文创建了一个离体的硅胶皮肤模型，以展示该设备打印和填充各种大小和几何形状缺损的能力。带有鲁尔锁端的商用喷嘴，如传统的钝头金属针，可以安装到微流体均质器的末端，用于填充狭窄的伤口。此外，本文还设计并3D打印了一个定制的平扇喷嘴，带有鲁尔锁耦合，用于以条状模式原位沉积大孔支架，快速填充大面积缺损。本文还开发了一个大圆形喷嘴，用于快速填充大面积的圆形缺损，如皮肤活检产生的缺损。
图3 手持式和自动化原位打印的演示
一步法打印大孔支架的物理表征
接下来，本文评估了一步法制备的多孔支架的机械性能和生物降解性能，并将其与实体GelMA进行了比较。为了评估机械性能，进行了轴向压缩力学测试（图4A）。通过结果应力-应变曲线前10%的斜率，本文量化了实体和泡沫水凝胶的压缩模量（图4B）。压缩测试显示，泡沫的压缩模量与本研究团队之前报道的通过机械搅拌生成的GelMA泡沫相似，接近软组织的值。然而，正如预期的那样，与实体15% GelMA水凝胶相比（约5 kPa vs 约50 kPa），泡沫的压缩模量显著较低。由于水凝胶的机械性能受其孔隙率的显著影响，因此一步法发泡器对孔隙率的控制能力是一个重要的因素，可用于解耦细胞经历的微观压缩模量和组织或宏观层面感受到的硬度。本文进一步证明，泡沫具有高度的可变形性（图4C），并且在加载后能够恢复其原始几何形状。此外，进行了循环压缩测试以评估支架的机械滞后性和对类似于生理体动的重复加载的弹性。测试在约50%的应变下进行了多达20个循环的循环压缩。支架展示了一致的滞后行为。具体来说，在最初的三个循环后，加载和卸载曲线没有观察到明显的变化，表明具有良好的可恢复性（图4D）。这对于在身体运动期间经历大应变的软组织植入物来说是至关重要的。
图4 一步打印法生产的泡沫与实体水凝胶的物理性能比较
体外生物学特性表征
为评估多孔支架的生物特性，本文将这些支架暴露于人类真皮成纤维细胞(HDF)培养中。此处选择HDFs有三个特定原因：它们作为初级细胞对细胞毒性环境的敏感性、它们在再生医学中的人源相关性，以及它们对体内伤口愈合实验的适用性。首先，制作了支架，并在支架上播种了细胞以评估支架的生物行为。这项调查旨在仔细检查一步打印泡沫的生物相容性和适宜性，以用于容纳细胞，同时也在体外环境中反映本文最终的体内策略。对于细胞播种研究，使用PrestoBlue活性检测法评估了五天跨度内的细胞增殖和存活率。正如图5A所示，荧光强度测量表明，在五天的时间里，接受一步打印泡沫和实体水凝胶处理的细胞代谢活动呈现一致的线性增加。有趣的是，PrestoBlue检测显示，与实体水凝胶相比，播种在一步打印泡沫样本上的细胞表现出显著更高的增殖。增加的增殖可能是由于一步打印泡沫结构的多孔性质，为细胞生长提供了更多空间，并在3D构建物内促进细胞增殖。这种行为通过Actin/DAPI染色培养物得到了证实（图5B,C）。虽然实体水凝胶具有生物相容的表面，并有明显的细胞增殖和扩散，但其小的内在孔隙限制了细胞向水凝胶内的渗透，促使细胞在样本表面形成密集的平面层（图5B）。相反，培养在多孔支架上的HDFs形成了在三维中生长的多层结构，形成了细胞网络（图5C）。HDFs的非平面性质通过细胞向下生长进入孔隙中的聚焦丝状扩散显示出来，显微照片中较暗的部分显示了这一点。
图5 一步法打印大孔支架的体外生物学表征
体内打印支架以治疗皮肤伤口
在诱导全层伤口后，伤口要么作为对照不进行治疗，要么用固体GelMA水凝胶或一步式打印的GelMA泡沫进行治疗（图6A）。所有伤口都用半透性的Tegaderm薄膜覆盖以防止感染。伤口被成像12天以进行定量。有趣的是，尽管使用了化学上相同的材料来制作固体水凝胶和泡沫，但这些组在整个研究中观察到的伤口闭合情况却有显著不同（图6B,C）。12天后，用固体水凝胶和泡沫支架治疗的伤口闭合率分别为54%对88%。无论是定量（图6B）还是定性（图6C），结果都表明，与Tegaderm对照组或多孔泡沫相比，添加固体水凝胶会阻碍伤口闭合。这与之前的研究结果一致，并表明具有非常小孔径的固体水凝胶无法容易被生物降解和侵入再生及免疫细胞。本文的体外降解和细胞培养结果进一步支持这一事实。另一方面，大孔泡沫使得降解和细胞浸润变得容易，并且与固体支架相比显著加速了伤口闭合（图6B,C）。虽然这项研究旨在开发一步式原位泡沫打印作为一种平台技术，将来可以与各种生物因子的传递相结合以促进伤口愈合，但泡沫支架本身在伤口闭合方面就超过了Tegaderm对照组，在第9天时具有统计学上的显著差异。
图6 全层伤口的鼠模型，用于展示一步法打印泡沫在转化医学上的可行性和再生潜力
在实验的第12天结束时，进行了组织学分析以评估伤口愈合的质量（图7）。苏木精和伊红（H&E）以及马松三色（MT）染色（图7A）显示所有组都有愈合的证据。然而，用泡沫处理的伤口显示出更成熟和先进的愈合迹象，如较厚的肉芽组织和毛囊的生长更多地向缺损中心进展所证明。相反，水凝胶组中的实体水凝胶通过物理阻挡伤口边缘的进展而阻碍了伤口闭合（图7A，红色箭头）。这证实了本文的假设，即实体水凝胶具有较慢的生物降解性，不允许细胞轻易渗透和支架重塑，而通过应用大孔泡沫支架可以解决这一问题。肉芽组织厚度的定量测量确认了相同的模式，即用一步法打印的大孔泡沫处理的伤口倾向于形成更厚的肉芽，尽管这种差异没有达到统计学意义（图7B）。
图7 用大孔泡沫支架治疗皮肤伤口后，通过组织学分析评估伤口愈合质量
2.总结与展望
这项研究为组织工程和再生医学领域的进一步研究开辟了许多途径。未来的调查可以探索其他生物材料、生物墨水配方以及超出皮肤伤口愈合之外的使用指征。对打印参数的微调和其他潜在医疗应用的探索将有助于扩展这项技术的应用。此外，为了使这项技术适用于治疗大面积伤口，可以不使用步进电机驱动的注射器，而是将墨盒外部放置，连接到蠕动泵上，以支持在更大规模和资源匮乏地区的使用。考虑到产生的泡沫体积是储存墨盒体积的三倍，可以在保持策略便携性的同时生成大体积的治疗泡沫。所提出的一步式原位生物打印方法在克服固体水凝胶基支架制造中现有局限性方面迈出了重要一步。精确度、可重复性和多功能性的结合使这项技术成为推进再生医学和组织工程的有前景的转化工具。
文章来源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202401944
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