3D生物打印仿生多层皮肤以改善伤口愈合

来源： 光谱与液芯器械医工交叉团队

修复全层皮肤缺损是临床实践中的一大挑战。活细胞和生物材料的生物打印是解决该挑战的一种很有前途的技术。然而，有限的生物材料来源、耗时的材料准备及其成型工艺是必须解决的瓶颈。基于此，来自解放军总医院的Minliang Chen团队在《ACS Applied Materials & Interfaces》期刊发表了题为“3D-Bioprinted Biomimetic Multilayer Implants Comprising Microfragmented Adipose Extracellular Matrix and Cells Improve Wound Healing in a Murine Model of Full-Thickness Skin Defects”的文章。该研究开发了一种新颖、快速且简单的方法。该方法直接处理脂肪组织以获得微碎片脂肪ECM(mFAECM)，但它无法打印。为了使mFAECM具有可打印性，将其与甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)混合制成复合生物墨水。同时，本研究以mFAECM为生物墨水主要成分，制备出对应真皮、表皮、血管化的不同生物墨水，完成仿生多层皮肤的生物打印。伤口愈合试验显示出生物打印的皮肤具有良好的治疗效果。

1、mFAECM的制备和表征

脂肪抽吸物经过三次冻融循环后均质化，得到均匀的乳化悬浮液。离心后，产品上层呈透明油状，中层呈淡黄色ECM，底层呈大而粗的纤维。获得 ECM后，用异丙醇反复萃取，直至无黄色油状物残留。均质后的ECM具有均匀致密的絮状外观。DAPI染色显示ECM碎片小于100 μm × 200 μm，因此可以轻松穿过内径为 300 μm的喷头。对mFAECM和天然组织主要成分的分析表明，胶原蛋白含量分别为110.38±9.60μg/mg和99.2±10.54μg/mg，sGAG(糖胺聚糖)含量分别为2.85±0.35μg/mg和3.11±0.40μg/mg。这表明天然组织的大部分胶原蛋白和sGAG保留在mFAECM中。胶原蛋白和糖胺聚糖对组织再生很重要，并负责调节伤口愈合过程中的组织稳态、细胞迁移和细胞信号传导。

图 1. mFAECM的制备和特性

2、仿生多层皮肤的制造
为了评估mFAECM复合生物墨水的可打印性，该研究应用3D打印制造了圆形、网状四层结构。该结构具有高保真度，并且与设计图案高度一致。高清相机拍摄的图像显示，生物墨水轨迹保持连续，每条细丝独立分布，不会合并或折叠。SEM图像显示细胞附着在孔隙上。总之，mFAECM复合生物墨水具有良好的可打印性和保真度，可以支持细胞附着。

图 2. 仿生多层皮肤的制造和微观结构

3、仿生多层皮肤促进小鼠的皮肤伤口愈合

目前还没关于直接将脂肪来源的、未经胃蛋白酶消化的ECM应用于生物打印构建皮肤的研究。为了评估由mFAECM和细胞组成的生物打印多层皮肤对体内伤口愈合的影响，该研究在裸鼠中制备了全层皮肤缺损模型。植入后第7天，细胞负载组创面面积最小，空白组创面面积最大。第14天，仅细胞负载组创面已完全闭合。形态学分析表明，生物打印仿生多层皮肤的创面愈合效果最好。H&E染色表明，植入后7天，细胞负载组修复效果优于脱细胞组和空白组。细胞负载组大部分表皮结构已形成，脱细胞组仍被构建体覆盖。空白组以血痂和脆弱的肉芽组织为主。14天时，细胞负载组和脱细胞组的表皮结构更加完整。与脱细胞组相比，细胞负载组的真皮结构分布更均匀，血管和纤维组织清晰可见。

图 3. 全层皮肤缺损小鼠的伤口愈合

4、仿生皮肤增强体内血管生成和胶原蛋白合成

组织工程最艰巨的挑战之一是新血管形成，它与营养物质向目标组织的输送直接相关。CD31是一种血管内皮细胞标记物，用于评估伤口愈合过程中的新毛细血管。免疫组化结果发现CD31表达在细胞负载组中明显较高。此外，RT-qPCR 分析显示，在第7天和第14天，载细胞组的VEGF表达明显高于无细胞组和空白组(见补充材料)。因此，可以发现仿生皮肤通过促进血管生成来加速伤口愈合。

图 4. 仿生多层皮肤对血管形成的影响

胶原蛋白在伤口愈合中起着重要作用，它提供组织强度，并促进细胞粘附和迁移。采用MT染色评估仿生多层皮肤对伤口胶原沉积的影响。与空白组相比，植入后第7天和第14天，载细胞和脱细胞植入物治疗的伤口中观察到更多的胶原纤维，且排列更有序。第7天，载细胞组的胶原面积明显大于脱细胞组和空白组。第14天，细胞负载组胶原面积也明显高于无细胞组和空白组。

图 5. 仿生多层植入物对胶原蛋白沉积的影响

5、总结
该研究描述了一种快速简便的方法，直接处理脂肪组织以获得mFAECM，并将它用作生物墨水的主要成分，以制造生物打印的载细胞仿生多层皮肤。结果表明，mFAECM复合生物墨水具有良好的可打印性和保真度，并能支持细胞粘附。仿生多层皮肤可以加速伤口愈合。这项研究提供了一种有效的方法来提高生物打印皮肤替代品的快速制造，这对于大规模全层皮肤缺损治疗至关重要。