干货： 全球细胞3D打印技术综述

南极熊导读：本文是由一个生物3D打印领域的博士所写的干货文章，对全球的细胞3D打印技术进行了综述，已于2019年1月发布在《新材料产业》上。
作者：赵  雨     上普博源(北京)生物科技有限公司

目前，英国有 5 000多人在等待移植新的肾脏。在接下来的一年里，经过 平均大约 30个月的等待后，他们中只 有不到一半的人会得到新的肾脏。其 余的人将继续等待，可他们不能永远 坚持下去:2016年，457名英国人在等 待新肾、新肝、新心脏或新肺的过程中 死亡。另有 875人由于已经病得无法 接受移植手术而从候补名单上被除 名。而在中国这种情况更为严重，据 统计，中国的人体器官的供需比仅为 1∶ 30，与英美发达国家的 1∶ 3左右 的供需比相差甚远。在数以万计的等 待者中，每年仅有几千名幸运儿可以 接受器官移植。

南极熊配图：艾伯尔生物3D打印技术

1 生物3D打印技术简介
如果科学家们不再依赖稀缺的捐 赠器官，而是能够在实验室中快速、廉 价地构建健康的新器官，并将患者自 身的细胞作为原材料，那会怎样?在 过去的约 15年里，这个梦想推动了在 生物 3D打印领域的投资和研究。生物 3D打印技术是将生物单元(细胞/蛋 白质/ D N A等)和生物材料按仿生形 态学，生物结构或生物体功能，细胞 特定微环境等要求用“三维打印”的技 术手段制造出具有个性化的体外三维 结构模型或三维生物功能结构体。其科学研究、技术应用和产业化发展广 涵于生物 3D打印装备和生物墨水的 研发及制造、高端医疗器械的制造、复 杂组织工程支架制造、体外生物功能 结构体的制造、生物/病理/药理模型 和新药检测模型制造等。

生物 3D打印作为一门新兴交叉 前沿技术领域，目前在国内外得到前 所未有的战略关注， 如美国增材生 物制造探讨，欧盟《制造业的未来 : 2015 ~2020战 略 报 告》、“十 三 五”规 划纲要、国家科学技术部/工业和信 息化部 3D打印战略规划等均将以细 胞和先进生物材料为基础的生物制造 和生物 3D打印技术视为国家重要战 略发展方向。

2 生物 3D 打印技术的应用
根据所用生物材料性能的不 同，清华大学生物 3D打印中心将目前 生物 3D打印技术分为 4个层次。
△南极熊配图：细胞3D打印应用，图片来自上普博源

第 1层次是打印无生物相容性要求的材料，可应用于 3D打印体外病例 模 型 、手 术 导 板 、3 D 打 印 体 外 假 肢 或 矫形辅具等领域，该层次的应用极大 地发挥了 3D打印在个性化定制方面 的优势，帮助相关病人量身定做相关 手术模型或治疗工具，可使病人得到 更好的治疗。

第 2层次是打印具有生物相容 性，但非降解材料。此类打印产品可以 作为体内永久植入物，材料可以是钛 合金等金属等材料，也可以是高分子 等惰性材料等，其中 3D打印金属植入 物厂商爱康医疗已获得多个C F D A上 市许可证书，产品已应用于临床。

第 3层次是打印具有良好生物相 容性且可降解的生物材料，主要的应 用领域为打印组织工程支架。其要求 打印的体内植入物不仅能与体内相 容，还要具有降解特性，在体内一定 时间促进体内缺损组织的生长和愈 合。由清华大学生物制造中心独创的 3D打印低温沉积制造技术集成了生 物 3D打印与冷冻干燥微观制孔技术 的优势，可实现同时具有宏观可控孔 隙(百微米级)与微观微丝孔隙(十微 米级)的组织工程支架的 3D打印，提 高了支架内的细胞种植率，更利于细 胞在支架内部的生长和组织功能的实 现，并在骨组织工程支架等领域应用 良好，并已开始向临床转化。

第 4层次是打印活性细胞，蛋白 及其他生物活性分子等，该层次的生 物 3D打印技术也被称作细胞 3D打印 技术。细胞 3D打印技术可以直接将细 胞、蛋白及其他具有生物活性的材料(例如蛋白质，D N A，生长因子等)作为 3D打印的基本单元，以 3D打印的方式，直接构建体外生物结构体、组织 或器官模型。


△南极熊配图



3 细胞3D打印的技术挑战
细胞 3D打印技术是目前生物 3D 打印技术的最前沿技术，也是实现器 官打印的最大潜在技术。打印过程 中，细胞必将承受一定的机械力，甚至 造成一定损伤，因此，细胞 3D打印技术的实现充满了各种技术挑战，细胞3D打印的技术挑战主要包括以下几 个方面。

3.1 材料能否打印
首先要选择能被生物 3D打印机 打印的生物材料/生物墨水，虽然不 同的打印工艺对生物墨水粘度有不 同要求，但总体来讲，太低粘度或太 高粘度的生物墨水，都很难被打印。因 此，细胞 3D打印的第一个挑战是要找 到可以被打印的生物墨水。
3.2 能否构建3D结构
并不是所有被打印的生物墨水都 可以构建 3D结构，为了打印出具有高 分辨率的 3D复杂细胞结构体，细胞打 印墨水需满足通过提高打印墨水的粘 度来提高生物墨水的凝胶能力，以维 持层层堆积结构体的力学性能。

3.3 细胞能否存活
增加细胞打印墨水的粘度，会导 致打印过程中细胞打印墨水中的细胞所承受的剪切力增加，从而导致打印 后细胞存活率的下降。因此，控制好打 印过程中细胞打印墨水的粘度(既不 能太高也不能太低)，寻找细胞打印墨 水的合适粘弹性区间，是实现良好细 胞三维打印(良好的成形性能与生物 学性能)的重要步骤。

3.4 是否具有功能性
刚打印的 3D细胞结构体，只是细 胞和生物材料的 3D组合体，并没有形 成组织特征。因此，打印的 3D细胞结 构体，必须经过适宜的培养条件，才能 形成组织功能性。此环节需要保证，生 物材料的生物相容性，力学性能和功 能性，培养基的充足供应和废物的充 分排出等。甚至有些组织需要特定的 生物反应器，通过流体，力或电的刺激 才能达到其功能性。

综上所述，细胞 3D打印的各个环 节充满了不同甚至具有一定相互矛盾 的技术挑战，需要多学科的交叉背景 知识和多年的经验积累去解决。

4 细胞 3D 打印技术分类
其根据其离散细胞墨水的方法主要可以分为 5类(表 1)。

4.1 喷墨式细胞打印技术
喷墨式细胞打印是基于普通喷 墨打印机的打印原理，利用热气泡或 压电的体积变化，挤压墨盒内的细胞 墨水，离散产生含有细胞的细胞墨水的微滴并喷射出去。喷墨打印机的 喷嘴直径仅有几十微米，可以进行高 精度的细胞打印，但是也由于其喷嘴 直径比较小，喷墨式细胞打印难以离 散打印高粘度的细胞墨水，使得此技 术直接打印三维生物学实体模型较困 难 ;此外，热气泡的产生和压电的变 形会对细胞造成一定损伤，需较好的 控制打印工艺参数。代表性研究机构 有德州大学的Boland教授课题组。

4.2 微挤出式细胞三维打印技术
微挤出式细胞三维打印技术，利 用机械力或气压等驱动力，直接通过微 喷头连续挤出生物材料和细胞构建三 维生物学结构体。由于常用的微挤 出式细胞打印机的喷嘴直径多在百微 米级，打印精度一般，但其挤出式的工 艺可以打印高粘弹性的生物墨水，易于 实现三维生物学实体的构建。此外，此 技术在牺牲精度的同时，使得打印出的 每一个离散单元体积变大，间接地提高 了打印效率和细胞存活率。代表的研究 机构有清华大学生物制造中心的孙伟 教 授 课 题 组 ，美 国 哈 佛 大 学 的 J e n n i f e r Lewis教授课题组。

4.3 激光直写式细胞打印技术
激光直写式细胞打印技术，是指 利用光压力控制细胞排列成具有高 精度的空间结构，其精度可达单细胞 量级，但提高的精度也导致成形效率 下降明显，该工艺也难以打印粘度较高的生物材料，使得其打印三维生物 学结构体的能力降低。代表的研究 机构有美国明尼苏达大学的David Odde教授课题组。

4.4 立体光刻细胞三维打印技术
立体光刻细胞三维打印技术，通过 激光或紫外光在空间的扫描运动实现对 含有细胞的光刻胶的立体固化成形，制 造出预设计的三维生物学结构。虽 然 这种技术具有高度的柔性，但其成型 效率却不如人意。部分开发者不再利 用激光细小的光斑扫描立体固化成 形，而是利用投影机原理，进行面投 射，每层同时固化成形。该工艺根据投 影机类型主要可以分为液晶投影仪 型和数字微镜(Digital Micromirror D e v i c e s , D M D )投 影 仪 型 ，两 者 的 本 质区别是液晶投影仪首先将光源分解 成 3种单色光，再分别通过 3个液晶片 控制 3种单色光的亮度，最终合成所 需的光和图案，而D M D只是利用一个 可以反射光源的数字阵列式微镜来实 现。该种工艺的光敏水凝胶预先存储 在成形室内，会造成材料浪费，以及难 以制造多种细胞的异质结构，且光敏 水凝胶多具有不同程度的毒性，使得 该种工艺的细胞存活率一般。代表的 研究机构有美国加州大学圣地亚哥分 校的Chen Shaochen课题组。

4.5 声波驱动式细胞打印技术
声波驱动式细胞打印技术是利用 声波的振动产生微滴喷射的方法，其 精度最小可达 10μ m左右，但该工艺 也是微滴喷射的方法，难以喷射高 粘度的生物材料，使得打印三维生 物学结构体的能力受到限制。代表 的研究机构有美国Stanford大学的 Demirci教授课题组。
综上所述，各种细胞打印方法各 有所长，但对于具有三维复杂异质生

物学结构体来说，微挤出式细胞三维 打印技术更为合适，其构建多细胞三 维模型更容易，效率更高，细胞存活 率高，打印精度(百微米级)也能满足 一般科研使用需求。所以，目前市场 上主流的细胞 3D打印机多是基于该 技术实现，代表公司有德国Envision TEC公司、瑞士Regen Hu公司，国内 的上普博源(北京)生物科技有限公司(SunP Biotech)、捷诺飞生物科技股 份有限公司等。

5 细胞 3D 打印的生物墨水分类
微挤出式细胞三维打印的生物 墨水有很多种，根据其溶胶-凝胶固 化转变原理可以分为以下几种方式( 表 2 )。

5.1 温敏水凝胶生物墨水
温敏水凝胶生物墨水可以通过 环境温度的改变实现其溶胶-凝胶 方式的转变。凝胶-溶胶转变温度在 0 ~37°C之间且生物相容性好的水 凝胶材料均有能力作为细胞打印墨 水。最具代表性的温敏水凝胶细胞 打印墨水为明胶。温敏水凝胶的溶胶 到凝胶的转变方式一般为可逆的，且 只要材料温度达到转变温度即可转 变，无需使用液体交联剂，不受交联剂 渗透深度影响，也不易出现液体交联 剂导致三维打印离散层层堆积时，层 与层之间出现的层间剥离现象，易于 构建大尺寸的三维细胞结构体。

5.2 离子交联式生物墨水
以海藻酸钠为代表的水凝胶材 料，可以通过与离子溶液相接触的方 式进行交联固化，实现溶胶-凝胶方 式的转变。但是此种离子置换的交联 方式反应很快，难以利用生物墨水与 交联剂预混合的方式打印，一般只能 利用含离子的液体进行浸泡或喷射在 生物墨水表面进行交联。但细胞三维 打印机若使用液体浸泡的方式进行 交联，易出现前文提到的层间剥离现 象，不利于打印三维生物学结构体。

5.3 酶促交联式生物墨水
以纤维蛋白原为代表的水凝 胶材料，可以通过与生物酶相接触的 方式进行交联，实现溶胶-凝胶方式 的转变。此种酶促交联方式一般反应 较慢，生物酶可以混入液体制成交联 剂，通过液体浸泡的方式进行交联，也 可以与水凝胶生物墨水预混合后，待 时间孵育交联。但溶胶到凝胶转变反 应慢，也增加了成形难度，不易于直接 打印三维结构体。

5.4 紫外光固化
部分合水凝胶材料经过合成改 性，再加入光引发剂，使得水凝胶生物 墨水具有光敏特性，可以通过紫外光 进行交联固化(例如G e l M A 等)。光 敏水凝胶一般强度高，紫外光的渗透 深度比一般液体交联剂的渗透深度更 深，但光引发剂的引入，会降低生物墨 水的生物活性。

6 细胞3D打印的未来
尽管目前细胞 3D打印已能打印 多种细胞，甚至可以构建一些简单的 组织等，但其距离器官打印还有一段 距离，未来值得关注一下几方面的研 究突破或趋势变化，以促进细胞 3D打 印技术的向前发展。

6.1 研究新型生物墨水
目前，尚不存在理想型的生物墨 水。基于天然生物材料的墨水生物相 容性好，但大多难以打印或力学性能 不好。基于人工合成高分子材料的墨 水打印性能或力学性能较好，但生物 活性一般较差，甚至有些材料没有经 过F D A认证。未来，研发打印性能和 生物学性能兼优的生物墨水将是行业 不可避免的趋势。

6.2 产业化促进整个领域快速向前
随着生物 3D打印产业化的不断 成熟，越来越多的厂商开始开发商业 化的生物 3D打印机，生物 3D打印机 的功能越来越强大，价格越来越低 廉。这使得新进入这个交叉领域的研 究者，尤其是材料学家，生物学家，医 生等非机械电子专业的研究者，可以 无需花精力在自己不擅长的打印机开 发领域，而专注于生物墨水的研发及 组织或器官的构建研究。因此，细胞 3D打印机的产业化正在促进这个领 域更快的发展。

6.3 提供细胞 3D 打印的专业化 服务将是未来的趋势
细胞 3D打印的交叉学科特性及 技术挑战，决定了其入门具有一定的门槛。因此，通过与有经验的科研机 构合作，或寻找有经验的公司进行技 术服务，将是此领域新入门者快速 获取知识并取得科研成果的便捷途 径。据此预测，具有高校研究背景的 细胞 3D打印的专业化服务公司将会 越来越多。

7 结语
近年，细胞 3D打印技术随着生物 3D打印机和生物墨水的产业化已走 进越来越多的实验室，更多的交叉领 域研究者一起投身到这个实现人类器 官再造梦想的领域。相信随着细胞 3D 打印领域的不断蓬勃发展，实现器官 打印的那天也不会太遥远。

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作者：赵  雨     上普博源(北京)生物科技有限公司

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