印度理工学院：使用无交联剂的丝素-明胶生物墨水进行软骨组织工程的3D生物打印

供稿人:韩康，贺健康

软骨是人体内高度分化的结缔组织，由于缺乏血管、淋巴系统和较低的细胞密度，致使其自我再生能力有限。因此，对该组织的任何损伤都会在人体内保留多年，使软骨进一步退化并最终引发关节功能受损，生活质量下降的退化性疾病（如骨关节炎）。

目前的治疗策略包括微骨折、嵌合成形术、骨软骨移植和自体软骨移植(ACI)。这些方法在很大程度上改善了缺损修复的效果，但往往会导致低性能软骨的形成，这只是延缓了组织退化的发生，延缓了骨关节炎的发生，并不是长期的临床解决方案。因此，迫切需要潜在的替代治疗方法。

近日，印度理工学院的研究者们开发了用于软骨再生不含交联剂的基于丝素-明胶生物墨水配方，该墨水由两种不同的丝素（桑蚕和蓖麻）以及明胶混合而成，当两种类型的丝素混合时，丝聚合物开始自凝胶化，明胶被缠结在这种凝胶丝基质上，形成了一种粘弹性墨水，是生物3D打印的最佳选择。此外，将猪原代软骨细胞封装在墨水中以制成生物墨水，并对其可打印性，打印保真度，生物学以及功能评估进行研究（图1）。

图1 （A）生物墨水配方，（B）生物聚合物的缠结和相互作用，（C）数字建模和（D）充满细胞的构建体的3D生物打印和成熟

研究者首先通过打印网格状结构和形如人耳的解剖结构证明了该墨水的高保真度，良好打印性以及尺寸稳定性。根据总体形态分析，构建体保留了其结构完整性（图2A-B）。打印的网格结构的尺寸为7.25×7.25×3mm 3，丝间间距为0.75mm，层间增量为0.25mm。在打印类似于人耳的解剖结构的情况下，尽管为较大的尺寸（33×20×12mm3），但在打印过程中，打印的构造物是稳定的，不会丢失其形状或塌陷。墨水的高保真度和合适的粘度表明其能够打印较大的解剖结构。

图2 墨水的打印保真度（A）网格状结构的打印（i）通过喷嘴挤出墨水，（ii）最初的几层，（iii）形成网格状图案； （B）人体解剖耳朵的制造（i）CAD模型和生成的STL文件，（ii）使用切片器生成的G代码，（iii）打印过程，以及（iv）打印的耳朵结构。

为表明开发的生物墨水配方具有细胞相容性，研究者使用钙黄绿素-AM染色评估了生物打印构建物中封装的软骨细胞的活力。图3A显示了在第1天和第14天的软骨细胞存活情况，该构建体表明软骨细胞具有典型球形形态的均匀分布以及良好的活性。作为钙黄绿素-AM染色的补充，图3B显示了在DAPI染色的冰冻切片中细胞的存在，且细胞均匀分布并排列成网格状结构。此外，H＆E染色显示整个构建体中细胞的附着和均一存在。

图3 免疫荧光染色 （A）钙黄绿素AM染色图像; （B）DAPI标记的亮蓝色细胞，和（C）构建体的H&E染色切片组织工程支架

总而言之，丝素-明胶聚合物共混生物墨水在软骨组织工程中的潜在应用显示出很高的可行性，并且可以根据需要进行结构，机械和生物相容性的定制化生物打印。

参考文献：
Singh, Y. P.; Bandyopadhyay, A.; Mandal, B. B., 3D Bioprinting Using Cross-Linker-Free Silk-Gelatin Bioink for Cartilage Tissue Engineering. ACS Appl Mater Interfaces 2019, 11 (37), 33684-33696.

供稿人:韩康，贺健康 供稿单位：机械制造系统工程国家重点实验室