AM: 载细胞4D生物打印，实现稳定多维结构打印

来源: EngineeringForLife

四维（4D）生物打印有望构建具有复杂几何形状和功能的细胞负载生物结构，用于组织/器官再生应用。开发基于水凝胶的4D生物墨水，特别是能支持活细胞打印、易于制备、成分明确、物理性能可控的4D生物墨水，对于4D生物打印至关重要。开发了一种不同于传统颗粒微凝胶的具有非均匀尺寸分布的单组分堵塞微薄片水凝胶（MFH）作为4D载细胞生物打印的新型生物墨水。由于MFH生物墨水具有细胞相容性、可规模的生产、剪切变稀、剪切屈服和快速自愈的特性，因此可以平滑地打印成稳定的3D生物结构，当加入光引发剂和UV吸收剂时，可以进一步交联以形成交联密度梯度。经过形状变形后，获得了各种结构清晰、细胞活力高的复杂生物结构。在此系统的基础上，作为概念演示了4D软骨样组织的打印，证明这种多功能的新型4D 生物墨水系统的建立可能会在组织工程中开辟许多应用领域。

近期，来自于University of Illinois at Chicago的Eben Alsberg教授在 Advanced Materias杂志上发表题为：Jammed Micro-Flake Hydrogel for 4D Living Cell Bioprinting的文章，开发了一种由离子交联氧化和甲基丙烯酸海藻酸盐（OMA）水凝胶组成的非均质单组分微薄片水凝胶（MFH）系统，作为负载细胞4D生物打印的生物墨水，最终实现了稳定的多维结构打印。当加入光引发剂（PI）和UV吸收剂时，进一步交联以形成在水凝胶内具有交联梯度的更坚固的水凝胶结构。根据特定的生物组织形状进行打印，从而获得具有复杂结构和高细胞活力的生物结构。

原理图 MFH系统的4D生物打印方案

首先，制备非均质单组分微薄片水凝胶（MFH）,第一步将氧化1%和甲基丙烯酸化30%的海藻酸盐（OMA）配成浓度为2%的溶液滴入Ca2+溶液（0.2m）中，与钙离子（Ca2+）完全交联形成离子交联水凝胶，使用家用搅拌机简单混合制备成MFH前体；第二步，MFH前体在用含有PI和UV吸收剂的介质清洗并重新组合后，变为具有片状形态（41.7±19.8μm）的“堵塞状态”。这些堵塞的微凝胶在低剪切应变下表现出类似固体的行为。一旦MFH受到增加的剪切速率或大于10%的剪切应变，将就会表现出典型的剪切变薄和剪切屈服行为。重要的是，在接受1%到100%的交替剪切应变时，MFH经历了快速且可重复的相变，证明了其快速自愈能力。

图1 （a）番红O染色MFHs的显微照片.（b）示意图显示了颗粒微凝胶的较低堆积密度（上）和较高堆积不规则MFH（下）.（c）MFHs微凝胶储能模量和损耗模量作为频率的函数（d）剪切速率和（e）超过10%应变的剪切应变.（f）随着剪切应变的增加，G“和G”交叉，表明剪切屈服。通过在1%和100%之间交替施加应变，快速恢复MFHs（g）模量和（h）粘度.（i）通过22号（22G）针（内径413μm）打印的灯丝显微照片。3D打印（j）水凝胶条（25×4×1 mm3）和（k）水凝胶长方体（10×8×6 mm3）的照片.

为了研究4D结构的形状变形行为，使用22G针以80%填充密度和4mm/s打印速度打印24 × 4 × 0.6 mm3水凝胶条，在整个厚度上具有梯度交联密度，产生弯曲角度的变形取决于结构尺寸、印刷参数、UV交联时间以及培养基。水凝胶条在三种介质（即去离子水（diH2O，S3）、PBS（pH 7.4）和细胞生长介质（GM））中弯曲到高交联侧，形成封闭或开放的水凝胶环，弯曲角度的显著变化是由水凝胶条在各自介质中的溶胀差异引起的。探究了填充密度、打印速度、针头的尺寸等打印参数以及不同的紫外线照射时间对弯曲角度的影响。此外，弯曲角度随水凝胶条的长度增加而增加，但不随宽度变化。

图2 水凝胶条在不同孵育溶液中或在不同参数下的4D形状变形行为

除了可编程变形外，还可以应用外部刺激变形，根据需要进一步操纵印刷结构的形状，为了证明通过外部刺激控制MFH结构形状变化的能力，研究了单组分单层梯度交联水凝胶条仅在pH刺激下的多个形状转变。

图3 视频快照显示了在室温下，水凝胶条在不同pH处理下的形状变化

为了证明将堵塞的MFH用作4D活细胞生物打印的细胞负载生物墨水的可行性，将成纤维细胞系（NIH3T3）、癌细胞系（HeLa）、原代干细胞（人骨髓间充质干细胞，hMSCs）分别与含有PI和UV吸收剂的MFH混合，打印水凝胶条，然后在GM中培养以研究产生的形状变化。在所有情况下，含细胞的水凝胶条显示出与无细胞相当的弯曲度，培养24小时后仍保持高度活性。受此启发，通过将梯度交联形成与基于掩模的光刻或复杂的生物打印几何设计相结合，来制造具有更复杂的各种生物结构。

图4 （a）MFH梯度水凝胶棒的弯曲行为，有无嵌入细胞。插图显示了弯曲水凝胶条的代表性显微照片.（b）装载NIH3T3的MFH结构的显微照片.（c）梯度水凝胶条中NIH3T3成纤维细胞的代表性活/死图像。（d） 装载细胞的“生物螺旋”结构的显微照片.（e）一个充满细胞的“bioS”结构的照片.（f）充满细胞的“伪四瓣”和（g）充满细胞的“伪六瓣”花的照片.插图照片显示了相应的打印结构。Kirigamibase结构和变形形态：水凝胶呈条状网格模式（h），没有和（i）具有内部水平条

目前，所有之前的4D生物打印工作仅呈现2D和/或2.5D的形状变换成3D结构，在z方向上有一定的附加）。据我们所知，通过4D生物打印或任何其他方法实现的细胞相容性生物材料与包裹细胞的3D到3D形状变形尚未见报道。MFH系统可以用3D打印出独立的各向异性结构，因此可以以可控的方式实现单个打印中制作的结构形状的转换，如“柱状夹持器”和“鱼翅片”很容易打印出来，然后通过控制光照射方向和暴露于光的区域，在两种代表性3D结构中创建多个位置特异性交联梯度。

图5 三维到三维形状变形的演示

为了在组织工程应用中利用这种形状变形策略，4D细胞负载结构能够和/或驱动封装细胞分化以及新组织的形成和成熟非常重要。4D生物打印MFH系统能够制造复杂的生物结构，同时促进功能组织的工程化。4D生物打印含hMSC的MFHs水凝胶条加入软骨形成介质（CM）中培养，以诱导形成具有相对预定义最终构型的软骨样组织。在21天的过程中，持续监测负载 hMSC水凝胶条的软骨形成及其形状变化。最初的直梯度水凝胶条在2小时内弯曲成“C”形，弯曲水凝胶条的形状在软骨形成过程中变化很小，表明4D生物结构具有良好的稳定性，为了量化软骨形成，分析了DNA水平和主要软骨细胞外基质成分糖胺聚糖（GAG）。随着时间的推移，DNA含量表现出相对稳定的水平，GAG产量稳步增加。

图6 基于MFH的4D生物打印技术在组织工程中的应用

总之，这种新的单组分非均匀尺寸分布的堵塞MFH系统被开发用于4D活细胞生物打印的载细胞生物墨水，新型生物墨水显示出理想的剪切变稀、剪切屈服和快速自愈特性，并在没有支撑浴的情况下以高分辨率和高保真度直接沉积各种3D生物结构，在生理条件下实现4D形状变化，水凝胶内有效生成交联梯度后维持高细胞活力。最终，概念证明4D软骨样组织在弯曲的水凝胶条和折叠的四瓣和六瓣花中形成，这种独特的4D生物打印系统将在4D组织和器官工程中有很好的应用前景，并可能有助于研究发育过程。

文章来源：
https://doi.org/10.1002/adma.202109394