微流控流式细胞打印技术，制备功能性肝细胞微球

来源 : EngineeringForLife  


三维培养的多细胞肝脏微球模型有利于肝纤维化治疗的发展。虽然这些模型可以再现纤维化疾病，但目前通过随机聚集产生微球方法是不受控制的，较易产生大小、功能和效用不稳定的球体。生物3D打印可以建立自动化成型，简化过程和增加可靠性。然而，舱室的加载仍然是随机的，产生了不均匀的组成和功能性质的微球。这种可变性降低了使用微球进行筛选的准确性和灵敏度。

为了实现卓越的体外肝脏建模，需要建立新的方法来创建具有可控结构、成分和功能特性的微球。近日，来自美国加利福尼亚大学的Adam R Abate团队利用微流控流式细胞打印技术（µFCP）成功制造了精密肝脏细胞微球。所产生的细胞球体具有优越的功能均匀性，与随机生成的球体相比，具有更准确的统计窗口。相关研究以“Controlled fabrication of functional liver spheroids with microfluidic flow cytometric printing”为题于2022年8月2日在线发表在Biofabrication上。

图1 微流控流式细胞打印技术产生肝细胞微球示意图

首先，作者将肝细胞（HepG2）细胞经胰蛋白酶处理后，通过26G针三次，使细胞团块断裂，制成单个HepG2细胞悬液。同样，肝星状细胞（HSC）也经胰酶和EDTA消化为单细胞悬液。基于微流控芯片开发的单细胞打印机可通过定制的LabVIEW界面实现自动化。作者采用康宁的6孔或384孔的圆底超低粘附微孔板作为印刷或被动加载基板。利用悬浮细胞制备细胞微球的一个挑战是，不是所有的细胞都是活的。因此，使用随机分隔技术，死亡的细胞包含在种子中，引入可以改变球形性质的可变性。用活性染料可以丢弃死细胞，这是一种独特而有价值的特性（图2）。

图2 与随机沉淀法相比，产生的细胞存活率和均匀度更高

球形大小由培养时间和种子中起始细胞的数量决定。为了说明µFCP在控制球体大小方面的效用，作者打印出具有不同细胞数量的种子，并监测它们的生长，与随机加载相比，最终的大小变异性要小约3倍。为了说明准确控制其成分的能力，我们使用两种方法构建了含有10个HepG2和10个造血干细胞的目标成分的球体。对于µFCP， HepG2细胞平均10.4个，HSC细胞平均10.1个，标准误差分别为0.9和0.8。对于随机加载，根据泊松分布，我们观察到HepG2细胞平均数量为9.4，HSC细胞平均数量为9.9，标准误差分别为3.4和3.6。因此，印刷的球体比随机加载产生的球体尺寸变异性低三倍。

图3 采用微流控单细胞打印技术制备多细胞肝球，得到更加均匀的多细胞肝脏微球

纤维形成依赖于肝细胞与造血干细胞的相互作用。因此，这些细胞的比例变化可导致不规则的球形功能。为了研究细胞比例对肝球形表型和纤维化模型的影响，作者打印了不同比例的HepG2和HSC，每个球形有100个细胞。培养6天后，观察到球体大小随着HSC数量的增加而减小。随着HSC数的进一步增加，紧致度渐近，球体的形状变得不规则。造血干细胞增加超过60%会导致非生理状态和次优球体。为了更深入地研究这一问题，作者量化了球形胶原蛋白的生成，这是纤维化中的关键功能性生物标志物。在50%以下，总胶原蛋白随星状细胞数量线性增加，每个星状细胞产生的胶原蛋白数量大致不变（图4）。

图4 肝细胞微球细胞型比例的系统研究

使用细胞微球进行药物筛选时，其大小和功能的均匀性直接影响准确性。由于µFCP可以制备均匀性的微球体，与随机技术相比，它可以提供更精确的筛选。为了评估药物反应的可变性，我们使用TGF-β1促纤维化化合物处理微球，这是一种有效的星状细胞激活刺激方式，导致I型胶原的产生。为了比较功能均匀性，我们通过计算I型胶原的面积来量化I型胶原的数量。实验表明，TGF-β1显著增加了打印的球状体和随机生成的球状体中的I型胶原，与随机生成的相对标准误差测量相比，打印出来的球体导致测量变异性降低，测量可变性大大增加了药物影响的统计显著性（图5）。

图5 单细胞打印肝细胞微球利于准确的体外药效评价

基于随机聚集所产生的肝细胞微球具有可变的尺寸和功能的缺点，限制了它们再现肝脏生物学和纤维化的可重复性，以及使用它们作为组织模型进行药物筛选的准确性。本文所提出的微流控单细胞打印方法克服了这些问题，肝细胞微球是由所需精确数量的细胞类型和高活力的细胞组成。将多路复用技术与单细胞精度相结合，可以精确地制作出设计复杂度更高的细胞微球，这将有助于研究如何控制细胞微球的性质或引入新的功能特性。

文章来源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac8622