来源：EngineeringForLife
现阶段，生物打印3D打印具有强大生命力的特定组织仍存在巨大的挑战，需要在细胞密度和水凝胶网络交联密度之间取得平衡。由组织特异性间充质干细胞和脱细胞基质微粒组成的微组织提供了一种实现仿生细胞密度和微环境的替代方案。然而，迄今为止，由于制造过程中的不稳定性，很少有研究用3D打印方法来制造它们。
为此，来自武汉协和医院整形外科的孙家明教授、汪振星教授团队开发了一种具有良好打印性和生物相容性的微组织生物墨水用于投影式光固化生物3D打印（EFL-BP-8600）。该研究通过将脱细胞基质微粒与GelMA水凝胶按一定比例交联的方法制备微组织生物墨水，所得到的微组织生物墨水具有理想的机械性能和溶胀率，对可打印性几乎没有影响。此外，研究团队使用基于残耳软骨细胞的微组织生物墨水制备了精细的耳廓结构，打印耳中的残耳软骨细胞在体外细胞增殖和体内耳软骨再生方面均有明显优势。该种微组织复合生物墨水，不仅能够准确组装器官构建块，还可以为细胞提供一个三维避难所，以确保打印细胞的生存能力。相关工作以题为“Microtissue-Based Bioink as A Chondrocyte Micro-Shelter for DLP Bioprinting”发表在Advanced Healthcare Materials杂志上。
图1 微组织生物墨水的制备及其用于投影式光固化生物打印的示意图
1. 残耳软骨细胞的提取与鉴定
首先，作者从小耳畸形患者的废弃残耳组织中提取残耳软骨细胞，并进行体外扩增和鉴定（图2）。作者分别对其软骨细胞特性和干细胞特性进行检测。免疫荧光结果显示，提取的残耳软骨细胞可以阳性表达软骨细胞相关标志物COL2和Aggrecan（图2B），以及干细胞相关标志物CD90、CD105和CD73（图2C）。qRT-PCR结果同样显示，软骨细胞相关基因COL2A1、Aggrecan和Elastin（图2D），干细胞相关基因OCT4A、NANOG和SOX2（图2E）在第1、2、3代残耳软骨细胞中均有不同水平的表达。以上结果表明，作者提取的残耳软骨细胞兼具软骨细胞特性和干细胞特性，与既往报道相符，并将用于下一步实验。
图2 残耳软骨细胞的提取与鉴定
2. 软骨脱细胞基质（CAM）的制备及微组织的构建
作者通过物理/化学/酶相结合的方法，成功制备了猪耳软骨脱细胞基质（CAM）（图3A）。组织学染色、DNA定量和GAG定量检测结果均显示，实验室制备的脱细胞基质符合国际标准（图3B-D）。接着，作者使用冷冻研磨法，将CAM制备成百微米级别的不溶性颗粒，作为微载体用于后续实验（图3E、F）。接种残耳软骨细胞后培养1、3、5天，细胞可以在CAM微载体上铺展、增殖，并分泌细胞外基质（图3G-I）。
图3 软骨脱细胞基质(CAM)的制备及软骨微组织的构建
3. CAM生物墨水的制备及表征
为了探究合适的生物墨水配方，作者分别对不同浓度、不同粒径的CAM墨水进行测试，以选择最佳配方用于体外细胞培养和体内软骨再生实验。作者将单纯GelMA、含1%CAM、5%CAM、10%CAM的GelMA墨水进行流变学测试、力学测试和溶胀率测试（图4A-E）。结果显示，含10%CAM组墨水的黏度最高、力学性能最强（压缩模量约为单纯GelMA的6.5倍）、溶胀率最低，更利于软骨细胞的长期存活、增殖和软骨微环境的仿生。因此，含有10%CAM的墨水配方被用于后续实验中。
接着，为保证复合墨水的相对均质性，作者将CAM筛选成0-150μm，150-300μm和＞300μm三组，并进行力学性能测试和溶胀率测试。结果显示，相同浓度下，0-150μm组的墨水力学性能更强，更接近天然软骨组织，而三组溶胀率并无统计学差异（图4F、G）。
图4 含有不同CAM浓度配比和粒径大小的生物墨水材料学表征
由于在投影式光固化3D打印的过程中，生物墨水基本处于静置状态，因此墨水的均质性是影响打印模型中微组织是否分布均匀的关键因素之一。基于此，作者继续对不同粒径CAM的复合墨水进行沉降实验，以观察在打印过程（不超过3h）内，生物墨水中CAM的沉降情况（图5）。作者分别观察了37℃下，含有10%不同粒径（0-150μm、150-300μm和＞300μm）CAM的沉降过程，并对沉降距离进行统计学分析。结果显示，0-150μm组的CAM复合墨水在3h内几乎不发生沉降现象，而随着CAM粒径的增加，150-300μm和＞300μm组的复合墨水在第1h时即观察到明显的沉降现象，第3h时沉降距离增加，且三组之间具有统计学差异。因此，0-150μm的CAM更能保证该复合生物墨水在打印过程中的均质性。
图5 在10% w/v浓度下，含有不同粒径CAM的生物墨水在37℃下的沉降特性
基于上述实验结果，作者选择浓度为10%w/v、粒径为0-150μm的CAM微粒与10%w/v的GelMA进行混合，用于后续生物墨水的制备及打印（图6A）。接着，作者对该符合生物墨水的可打印性进行测试，以探讨CAM的加入是否会影响光固化打印性能。作者首先对打印参数进行了测试，结果表明，CAM的加入使单层曝光时间由30s延长到了35s，但仍能实现模型的交联定型（图6B）。通过打印不同精度的模型，测试CAM的加入对可打印性的影响。结果显示，加入CAM后，与单纯的GelMA相比，打印模型的透明度降低、边缘略显粗糙，但基本不会影响打印精度，同时还会提高模型的力学性能，使模型的支撑性能更强（图6C）。作者打印出立体和平面的耳型支架，并进行弹性测试（图6D-F）。结果显示，加入CAM后，打印模型对应的解剖结构清晰可见，弹性更强。说明本研究制备的复合生物墨水可满足投影式光固化3D打印要求，具有良好的打印性和弹性。
图6 CAM生物墨水的可打印性测试
4. 微组织生物墨水的生物打印及体外长期培养
作者将残耳软骨细胞接种于CAM微载体上构建软骨微组织，混合GelMA后制备出微组织生物墨水并打印成耳型支架，用于体外长期培养。结果显示，与单纯的GelMA+细胞组相比，GelMA+微组织组中的软骨细胞增殖更快、更加铺展、细胞外基质分泌更多（图7C、D），软骨相关标志物Aggrecan和COL2的表达水平更高（图7E、F）。Transwell结果显示，与微组织共培养的软骨细胞中COL2的水平更高，可能是由于微组织上的细胞可以分泌更多的软骨相关生长因子（图7G、H）。以上结果表明，微组织生物墨水在体外长期培养中效果更好。
图7 微组织生物墨水的生物打印和体外长期培养情况
5. 微组织生物墨水的体内软骨再生情况
为了探究微组织生物墨水体内再生软骨的效果，作者分别打印了4组耳型支架：单纯GelMA组、GelMA+软骨细胞组、GelMA+CAM微载体组和GelMA+微组织组，埋入裸鼠皮下进行体内实验。6周和12周后取材，结果显示，除GelMA+CAM微载体组外，其余三组支架均保有完好的耳型（图8B）。将各组支架进行冰冻切片并组织学染色，其中GelMA+软骨细胞组和GelMA+微组织组均可见再生的软骨成分。在第12周时，微组织组中的软骨细胞大面积增殖、胶原蛋白成片分布，明显优于GelMA+软骨细胞组，软骨相关基因COL2A1和Aggrecan的表达水平也更高。
图8 体内实验验证耳支架内的软骨再生情况
作者对四组支架进行抗人LaminA/C的免疫荧光染色，以确定再生细胞的来源（图9）。结果显示，GelMA+软骨细胞组和GelMA+微组织组中的细胞基本为人源细胞，说明由植入的人残耳软骨细胞增殖而来，从而为日后的临床应用提供了基础。
图9 抗人Lamin A/C免疫荧光染色图像鉴定细胞来源
近年来3D生物打印技术发展迅速，在组织工程中得到广泛应用。随着印刷技术的不断发展，生物墨水的优化变得越来越重要。然而，大多数生物墨水是通过直接混合细胞和水凝胶溶液来进行打印的。这种方法使细胞在水凝胶中处于单细胞状态，不能及时建立有效的细胞间连接，影响细胞外基质的分泌。在本项工作中，作者开发了一种基于微组织的生物墨水来克服上述限制。将残耳软骨细胞与软骨脱细胞基质（CAM）微载体结合构建软骨微组织，可模拟细胞三维生长微环境，及时建立细胞间连接。将微组织与GelMA混合制备的生物墨水可通过投影式光固化3D打印技术加工成高弹性、高打印精度和低溶胀率的耳支架。体外长期培养后可见大量细胞外基质沉积，裸鼠皮下植入12周可观察到大量成熟软骨再生。这种软骨微组织生物墨水具有良好的生物相容性和力学性能，为生物墨水的优化提供了新的思路，为小耳畸形患者的治疗带来了新的希望。
文章来源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202201877
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