《AHM》：挤出式生物3D打印实现均匀表皮层工程

来源： EngineeringForLife

为了重建一个理想的全层皮肤模型，基底角质形成细胞必须以融合的单层形式分布在真皮上。然而，目前可用的皮肤挤出式生物打印方法在产生空气暴露的细胞单层时受到限制，因为细胞被封装在生物墨水中。北京理工大学高戈副研究员和韩国浦项科技大学Dong-Woo Cho、釜山大学Byoung Soo Kim第一次通过使用牺牲明胶辅助挤出式生物打印复制均匀和分层的表皮层研究。对流变特性、可打印性、细胞活力和初始角质形成细胞粘附的实验分析表明，最佳明胶生物胶浓度为4 wt.%。用于实现融合的角质形成细胞层的生物打印明胶结构的适当厚度为400 μm。建议的策略产生一个均匀的角质形成细胞单层，在整个中央和外周区域有紧密的连接，而人工播种产生不均匀的细胞聚集和空位。这些结果影响基因表达，表现出表皮分化倾向。最后，将明胶辅助的角质形成细胞生物打印到由甲基丙烯酰基明胶和真皮衍生的脱细胞细胞外基质组成的真皮上，建立全层皮肤模型。因此，这种策略可以显著改善表皮的分化/分层。本研究结果表明明胶辅助方法有利于重建可靠的全层皮肤模型，具有显著的一致性。

相关研究内容以“Engineering of Uniform Epidermal Layers via Sacrificial Gelatin Bioink-Assisted 3D Extrusion Bioprinting of Skin”为题于2023年8月3日发表在《Advanced Healthcare Materials》。

图1 本研究中应用的总体策略和工作流程示意图

皮肤由真皮层和表皮层组成，通常被称为全层皮肤（图1A）。明胶的一个独特特征是它的热敏性，这允许它在低温下形成物理键，同时可在高温下溶解（图1B）。通过评估流变学特性、打印能力、细胞活力和初始角质形成细胞粘附分析结果，研究了牺牲明胶生物墨水的最佳条件（1−12wt%）（图1C）。与人工播种方法相比，本研究使用已建立的明胶生物墨水的新策略成功地在整个中心和外周区域创建了一个统一的角质形成细胞单层，具有紧密连接蛋白（E-钙粘蛋白）（图1D）。当应用牺牲明胶辅助挤出式生物打印时，无论人类真皮成纤维细胞（HDF）的ECM成分如何，真皮（真皮衍生脱细胞ECM）或甲基丙烯酰明胶)中的表皮的形成和表皮分化标记物的上调（图1E）。这些结果表明，本研究所提出的牺牲明胶辅助挤出式生物打印策略是一种很有前途的生物制造技术，可以稳定地再现具有优越的重复性的大规模生产。

图2 基于不同温度下的流变学分析的不同浓度（1−12重量%）明胶基生物墨水的可打印性试验

在10到37℃的温度下，使用不同浓度的明胶生物墨水（1−12wt%）研究了流变特性（图2A）。在10℃下，1 wt%明胶生物墨水的粘度为8.2Pa·s，随着温度的升高而迅速下降，且在相同的温度范围内，较低浓度的明胶生物墨水具有较高的粘度分布。在10、15、20和25℃下对其打印性进行分析，根据其视觉挤出式形式将结果分为以下四种类型：泄漏、规则、不规则和不可挤出式（图2Bi）。根据可打印性试验和流变粘度结果，根据各自的挤出式形式建立了粘度范围（图2Bii）。通过水平放置含有8%明胶生物墨水的小瓶来观察不同的挤出式形式，可以直观地观察粘性（图2C）。通过调节打印温度，研究了使用不同挤出式类型挤出式明胶生物墨水所需的最小压力，泄漏式生物墨水在没有气动压力的情况下在喷嘴尖端形成一个液滴，表明无法精确控制充满细胞的生物墨水的数量；在规则的挤出温度范围内，明胶生物墨水可以在12 kPa处以果冻状挤出（图2D）。通过为每种打印类型创建三个网格图案的方块，评估了可打印挤出式类型的打印精度，即规则类型和不规则类型，当明胶生物墨被有规律地挤出式时，网格结构之间没有显著差异。（图2E）。使用两种可打印的明胶生物墨水，通过逐层打印的方式获得了固体和多孔的3D结构（图2Fi、ii）。以上结果表明，通过调节打印温度，可以精确地调整明胶基生物墨水的流变特性。

图3 利用牺牲明胶生物墨水建立挤出式生物打印条件，以产生均匀和融合的细胞高效的角质形成细胞单层

生物墨水的粘度升高可能会损害细胞，因为在穿透喷嘴时会发生过度的剪切应力（图3A）。为了评估规则和不规则挤出式类型对细胞活力的影响，将人表皮角质形成细胞（HEKs）封装在4wt%和8wt%的明胶生物墨水中，然后在上述温度下进行挤出式，以产生规则和不规则的挤出式（图3Bi）。活/死染色定量结果显示，常规型挤出式的大部分HEKs具有较高的细胞活力（图3Bii）。对4wt%和8wt%的明胶生物墨水进行流变学评估，以确定其在温度从10°C升高到37°C时的流变学特性（图3C）。结果表明生物墨水表现出流体主导的特性。通过F-actin染色，在培养板上的明胶辅助挤出式生物打印观察了HEKs的初始粘附，并将其与在2D底物上培养的组进行了比较（图3Di、ii）。使用常规挤出式方法，将明胶结构的厚度从100μm增加到1200 μm，挤出式HEK-4wt%明胶生物墨水，以获得融合的角质形成细胞单层；z-堆叠共聚焦结果显示，> 600 μm的明胶结构导致了多层HEK聚集体的形成（图3E）。因此，确定HEK内嵌明胶结构的最佳厚度为400 μm，确保形成均匀的角质形成细胞单层。利用明胶的热敏性，本研究成功地建立了牺牲明胶辅助挤出式生物打印形成融合的角质形成细胞单层的条件。

图4 牺牲明胶辅助挤出式生物打印与人工播种方法的比较

基于已建立的明胶辅助挤出式生物打印条件，将牺牲明胶生物墨水中的HEKs均匀挤出式在3D打印的合成聚合物15 mm x 15 mm方形框架中（图4A）。为了深入分析它们的功能附着和分布，使用共聚焦显微镜捕获了中心（图4B）和外围（图4C）区域的表面图像。结果表明，用明胶生物墨水生物打印的HEKs在整个表面均匀地附着，没有空隙；而人工播种的HEKs在两个区域都留下了几个未附着的空间。在使用常规方法时可以观察到部分没有细胞的空白区域（图4D）。使用具有代表性的分层表皮早期分化标记物，如角蛋白1（KRT1）、外皮蛋白（IVL）和兜甲蛋白（LOR）来评估基因表达，结果显示，与人工组相比，生物打印组的所有基因均显著上调（图4E），表明通过明胶生物墨水形成的均匀角质形成细胞单层可以促进整个真皮室表皮的形成。生物打印组显示E-钙粘蛋白的基因表达水平显著增加（图4F），表明整个表面HEKs之间细胞间连接的形成增强。使用ELISA对人工和生物打印方法挤出式的分离HEKs中，紧密连接蛋白的水平进行定量分析，包括occludin、zonula occludens-1（ZO-1）和claudin-1，结果显示生物打印组紧密连接蛋白显著高于手动组（图4G)。

图5 使用所提出的牺牲明胶辅助的3D皮肤挤出式生物打印技术制造均匀的表皮层

如图5A所示，按照体外皮肤工程的典型过程重建了生物打印的皮肤模型。5天后，嵌入的HDFs均显示出较高的细胞活力和稳定的形态（图5B）。组织学图像显示，所有使用常规或挤出式生物打印方法创建的皮肤模型，在气液界面（ALI）培养10天后，都显示出表皮分层（图5C），表明HEKs成功分化。使用本研究中的策略创建的全层皮肤模型在基于GelMA-和D-dECM的皮肤等效物上的表皮厚度分别为74.4 ± 3.5和98.4 ± 4.1 μm，是手动组的两倍（图5D）。生物打印表皮的基因表达比较结果显示，与人工播种法诱导的表皮相比，具有代表性的分化标志物，包括角蛋白19、角蛋白10和IVL的水平显著升高（图5E）。这些标记物是角质形成细胞分化和成熟的指标，在生物打印表皮中的上调表明了一个更先进和更有组织的分化过程。使用具有代表性的早期（IVL）和晚期（KRT10）表皮分化标记物的共聚焦图像显示，与皮肤工程中使用的传统人工播种方法相比，明胶-生物墨水辅助生物打印方法表现出更有组织的表皮结构（图5F）。为了评估表面润湿性，测量了无表皮的真皮腔室（无表皮）和由人工和生物打印方法创建的皮肤模型的接触角，当未形成表皮时，生物打印诱导的表皮角度明显高于人工打印诱导的表皮角度（图5G）。与没有表皮的结构相比，手工皮肤模型的阻力显著增加（图5H）。此外，还研究了使用70 kDa右旋糖酐溶液处理1h后的渗透性，结果表明，无表皮组的右旋糖酐溶液渗透速度明显快于表皮层状的全层皮肤模型（图5I）。综上，生物打印皮肤模型的右旋糖酐扩散水平明显低于手动模型，表明生物打印诱导的表皮细胞间连接良好，有效地阻止了水分子的扩散。

本研究成功地证明了牺牲明胶辅助3D皮肤挤出式生物打印是一种很有前途的技术，用于重建可靠的全层皮肤模型，具有优越的大规模生产，且确定了明胶生物墨水的最佳浓度，并建立了挤出式生物打印条件，以均匀地覆盖3D真皮在一个融合的细胞单层。最后验证了与人工播种模型相比，人工明胶辅助的3D皮肤挤出式生物打印策略显著改善了表皮的分化和分层。

本文强调了利用牺牲明胶生物墨水的3D皮肤挤出式生物打印技术作为工程先进皮肤模型的可行选择，可用于各种皮肤和临床应用，包括药物测试、疾病建模、毒性筛选和个性化医疗。此外，本研究中的方法可能提供一种替代动物测试，并提供更多的预测结果。未来的研究可以通过研究3D生物打印皮肤模型的长期稳定性和功能，并扩大该技术的应用范围，进一步改进目前的工作。

文章来源：

https://doi.org/10.1002/adhm.202301015