TIBI研究人员成功3D 打印肌肉组织，为肌肉修复和再生提供新疗法

导读：近年来，增材制造行业经历了强劲增长，并在众多专业领域开辟了新的机遇。除了汽车行业或航空航天领域之外，3D 打印的应用也越来越广泛，尤其是在医疗领域涌现了许多创新案例。

2023年9月15日，南极熊获悉，Terasaki 生物医学创新研究所 (TIBI) 的科学家在类天然骨骼肌组织的 3D 生物打印方面取得了进展：研究人员针对受损肌肉组织的恢复开发了一种新的治疗方法，首次实现了3D 打印肌肉组织的生产和试验。TIBI 科学家方法的关键在于他们专门配制的生物墨水，其中含有专为持续输送胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 而设计的微粒。

相关研究以题为“Enhanced Maturation of 3DBioprinted Skeletal Muscle Tissue Constructs Encapsulating SolubleFactor-Releasing Microparticles”的论文被发表在《MacromolecularBioscience》期刊上。

相关论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/mabi.202300276

由于创伤、疾病或外科手术而导致的骨骼肌损失不仅会导致功能障碍，还会对相关组织（例如血管和其他结构组织）造成损害。目前对这种肌肉损失的治疗是将患者的健康肌肉组织从不同部位转移到受伤部位。然而，移植组织的神经支配不足和其他并发症可能会阻碍肌肉的全面恢复。肌肉发育的正常过程是渐进的，其中称为成肌细胞的圆形肌肉前体细胞融合形成称为肌管的管状细胞。这些肌管最终发育成成熟的肌纤维。除了肌肉细胞成熟之外，精确的细胞排列和定向对于成功的肌肉收缩和功能也至关重要。

人们已经努力对功能性骨骼肌组织进行生物工程改造，但大多数方法都面临着各自的挑战。例如，尝试使用静电纺丝方法工程化类似天然的骨骼肌组织，已经产生了具有适当的结构排列和方向的肌肉组织，用于修复和再生；然而，组织的细胞成熟和肌肉收缩的能力已被证明是不够的。

为了解决这个问题，Terasaki研究所的研究人员尝试采用 3D 生物打印技术，并开发由 GelMA（一种生物相容性明胶水凝胶）、成肌细胞和专为持续递送 IGF-1 设计的微粒组成的生物墨水。这种生物墨水能够模仿自然肌肉的形成，以生成合成肌肉组织。这项创新技术有望成为解决因受伤、疾病或手术而导致肌肉损失的一种新的治疗方案。

△该生物墨水由水凝胶、成肌细胞和微粒组成（照片来源：Terasaki研究所）

△可溶性因子释放生物墨水的示意图。A) GelMA 凝胶与负载有生长因子 IGF-1 的 PLGA 微粒相结合，产生 B) 可溶性因子释放生物墨水。C）所得生物墨水可以进行3D打印，共价光交联后对细胞友好且稳定。D) GelMA 3D 打印纤维与 PLGA/IGF-1 微粒相结合，为细胞生长、排列和分化为 E) 肌肉微组织提供了最佳条件。（比例尺：C）2 毫米；E）100微米）。

△微流体辅助制造聚合物微粒。A) 微流体 T 形连接装置的方案。B)氧等离子体和 PVA 涂层处理的接触角（****  p  <0.0001；*** p  < 0.001；**  p  < 0.01；*  p  <0.05）。C) 来自微流体装置和 T 形接头设计中的 PLGA 液滴生成的图像，随后是获得清洁和干燥的 PLGA 微粒的步骤（比例尺：3 毫米；1 毫米）。D) 干燥球形 PLGA 微粒的 SEM 图像（比例尺：40 µm）。E) 平均直径和多分散指数。

△PLGA 微粒与带正电荷的蛋白质相互作用。A) PLGA 微粒与 FITC-BSA 相互作用的荧光显微镜图像（比例尺：100 µm）。PLGA 微粒吸附的 B) BSA 和C) IGF-1 的定量。D) IGF-1 从 PLGA 微粒中释放。E) IGF-1 从封装在 GelMA 水凝胶中的 PLGA 微粒中释放。

△包含 PLGA/IGF-1 微粒和 C2C12 细胞的 3D 生物打印结构。A) 3D 生物打印过程示意图，随后进行细胞排列和分化。B) 第 3 天的活-死荧光测定。活细胞用钙黄绿素（绿色）染色，死细胞用碘化丙啶（红色）染色。CD) 培养 3 天后生物打印细胞的DAPI/肌动蛋白荧光染色。细胞核用 DAPI（蓝色）染色，肌动蛋白丝用鬼笔环肽（绿色）染色（D：比例尺为 40 µm）。EG）第 7 天含有 PLGA/IGF-1 微粒的水凝胶内肌管形成的免疫荧光和明场图像。比例尺：100 µm。

△肌管形态的表征。A) 在含有 PLGA 或PLGA/IGF-1 微粒的水凝胶中形成的肌管的代表性 MHC（绿色）免疫荧光染色（比例尺：100 µm）。B) 在含有 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝胶中培养后肌管的长度、直径、长宽比和面积的分析。p值<0.05被认为具有统计显着性。( ****  p  <0.0001; ***  p <  0.001; ** p  < 0.01; *  p < 0.05）。C) 掺入 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝胶中肌管角度的定量。直方图显示了肌管在水凝胶方向上的排列分布。

△GelMA/PLGA/IGF-1 水凝胶打印后 10 天的肌管抽搐特征。A) 电影（电影 S1，支持信息）的屏幕截图，显示包含 C2C12 细胞和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝胶的自发收缩。黄色箭头显示水凝胶的自发抽搐运动（比例尺：100 µm）。B) 包含 C2C12 细胞和 PLGA/IGF-1 微粒的水凝胶的电影（电影S2 ，支持信息）的屏幕截图以及相应的 MHC（绿色）免疫荧光染色。CD) 分析含有 PLGA 和 PLGA/IGF-1 微粒的生物墨水中发达肌肉组织的抽搐面积和抽搐幅度。p值<0.05被认为具有统计显着性。（****p  < 0.0001；*** p  < 0.001；** p  < 0.01；* p  < 0.05）。

△使用 CD68、F4/80 和核染色对皮下植入物进行免疫组织化学染色。A) 皮下植入 4 周后，带有 CD68、F4/80 和核染色的薄样品的宽场荧光图像（比例尺 X4：430 µm，X10：170 µm。红色：F4/80，绿色：CD68 和蓝色：DAPI）。B) 厚组织切片的 CLSM z 堆栈图像（比例尺：150 和 50 µm。洋红色：泛单核细胞/巨噬细胞标记，青色：细胞核）。

△术后六周进行体内 VML 评估。不同成分（GelMA/PLGA/IGF-1、GelMA/PLGA 和 GelMA/IGF-1）的 GelMA 植入物的 VML 模型评估，无治疗对照为假模型。对样品进行苏木精和曙红染色（比例尺左图：500 µm，右图：100 µm）。

肌肉组织的生成是一项复杂的任务，因为它由不同的细胞类型组成，并受到生化和生物力学信号通路的调节。研究人员重点关注生长因子-1 (IGF-1) 的使用，这是一种具有类胰岛素结构的激素，是正常骨骼和组织生长所需的。持续输送 IGF-1 可以增强肌肉前体细胞形成成熟骨骼肌组织，并促进其结构排列。这提高了再生过程的效率，并可以为遭受肌肉损失或受伤的人带来成功的治疗。

打印三天后，成肌细胞被认为是可行的，IGF-1 存在至少十天后可促进肌肉再生和修复并发育成l 完整的合成肌肉组织，。为了使 IGF-1 持续释放数天，研究人员使用微流体系统制造了涂有 IGF-1 的大小均匀的微粒。随着颗粒的降解，IGF-1逐渐从微粒表面释放。

使用新的生物墨水创建肌肉结构一周后，研究人员观察到成肌细胞排列、融合和分化为肌管的能力增强，并且与没有持续释放 IGF-1 的结构相比，肌管的生长和伸长显着增加。有趣的是，生物打印十天后，持续释放IGF-1 的肌肉组织结构开始自发收缩。

对植入 3D 生物打印肌肉组织结构的小鼠进行了临床前研究。那些植入可持续释放 IGF-1 的肌肉组织结构的小鼠在植入六周后表现出最高程度的肌肉组织再生。其他体内实验表明，IGF-1 的持续释放还引发了良好调节的炎症反应，这被证明有利于组织修复。

TIBI 董事兼首席执行官 AliKhademhosseini 博士说：“IGF-1 的持续释放促进肌肉细胞的成熟和排列，这是肌肉组织修复和再生的关键一步。利用这种策略来治疗性地创建功能性、收缩性肌肉组织具有巨大的潜力。”

3D 打印肌肉组织代表了医学的重大进步。通过模仿肌肉形成的自然过程，这项技术可以彻底改变肌肉质量的替代。目前，还需要进一步的临床研究和测试，以便在治疗人类之前确认这一过程的安全性。然而可以肯定的是，3D 打印肌肉组织为医学的未来提供了非常有希望的前景。