3D打印仿真半月板支架结合自体滑膜移植有望克服半月板再生问题

来源：EngineeringForLife

半月板是膝关节内复杂而重要的纤维软骨组织。目前半月板再生仍是一项较为困难的问题。近日，来自北京大学的敖英芳、程锦、胡晓青教授团队进行了受半月板成熟和再生过程启发的半月板再生技术的相关研究。研究成果以“Meniscal fibrocartilage regeneration inspired by meniscal maturational and regenerative process”为题于11月08日发表在《Science Advances》上。

本文利用转基因小鼠模型明确间充质干细胞参与半月板的成熟和再生过程。同时受半月板成熟和再生过程启发，研究人员开发了一种有效的转化策略，通过3D打印生物仿真半月板支架，结合自体滑膜移植，促进半月板再生。在大型动物模型中本文验证了该方法可以促进各向异性半月板样组织再生，并保护软骨免于退化。从机制上讲，生物支架的力学特性和基质硬度上调Piezo1的表达，促进钙调素和NFATc1协同激活，进一步激活YAP-pSmad2/3-SOX9轴，从而诱导间充质干细胞形成纤维软骨，进一步促进半月板再生。此外，力学特性和基质硬度激活的Piezo1可进一步上调胶原交联酶的表达，从而催化胶原交联，进而增强再生组织的机械性能。

本文从以下几个方面进行详细描述

1. 间充质干细胞参与转基因小鼠半月板成熟和再生过程

2. 3D打印PCL支架结合自体滑膜移植策略在大型动物模型中促进半月板再生并保护软骨免于退化

3. 生物力学刺激通过YAP-pSmad2/3-SOX9轴诱导间充质干细胞形成纤维软骨

4. Piezo1通过协同激活钙调素和NFAT介导机械传导

5. 基质硬度对YAP-pSmad2/3-SOX9轴的影响分析

6. 半月板再生过程中胶原交联重塑分析

图1 通过转基因小鼠明确间充质干细胞在半月板成熟和再生中的作用

为确定间充质干细胞在半月板成熟过程中的作用，本文使用转基因小鼠进行鉴定。血小板衍生生长因子α（Pdgfrα）阳性间充质干细胞表达tdtomato蛋白（红色荧光蛋白（RFP））。小鼠出生后8周开始使用他莫昔芬诱导1周，10周取出小鼠膝关节。免疫荧光染色显示，半月板中存在RFP/SOX9/Collagen I (COL I)/COL II阳性细胞。表明间充质干细胞在出生后8至10周时间内分化为半月板纤维软骨细胞。出生后10周间充质干细胞在仍存在半月板中。因此，间充质干细胞参与小鼠半月板的成熟过程。之前研究表明，小鼠等小动物模型具有相对较强的体内愈合能力。小动物可能是研究半月板再生过程的合适模型。为研究间充质干细胞在半月板再生中的作用，在对Pdgfrα-CreER; Rosa26-LSL-Tdtomato转基因小鼠诱导后，接着对内侧半月板行半月板全切或次全切。术后3月，通过组织染色发现大量富含糖胺聚糖（GAG）、COL I和COL II的再生半月板纤维软骨样组织。此外，再生组织中还出现RFP/COL I/COL II/SOX9阳性细胞。表明间充质干细胞参与半月板的再生过程，分化为半月板纤维软骨细胞。总之，以上结果表明间充质干细胞参与小鼠半月板的成熟和再生过程。

图2 3D打印半月板支架结合自体滑膜移植促进半月板再生，在猪半月板次全切模型中保护软骨免于退化

为验证自体滑膜移植对半月板再生的影响，本文使用小鼠半月板次全切（90%切除）模型。首先，对内侧半月板进行次全切。接着按解剖结构植入3D打印的聚ε-己内酯（PCL）半月板支架，并用缝线固定残余半月板组织，从髌上滑囊取自体滑膜组织，并将其铺在表面（图2A3）。最后对关节结构进行复位。为追踪半月板再生和软骨状况，术后两个月进行微创关节镜检查。经过综合评估，关节腔内未发现松动假体，半月板支架完整而牢固的固定在其中。整个半月板支架都被新形成血管丰富的组织覆盖。为进一步评估新形成组织的含量和软骨情况，术后2个月研究人员进行取材，结果发现再生组织在形态和颜色上与原生半月板相似，且对胫骨软骨覆盖、外周囊连接以及胫骨平台的前后附着保持良好（图2，C1至C3）。胫骨内侧平台和股骨内侧髁（MFC）只有轻微软骨磨损。髌股关节未发现软骨退化情况。内侧副韧带附着点骨块愈合良好。术后4个月，再生组织与原生半月板相似度进一步提高。胫骨内侧平台存在适度软骨磨损。在MFC中仅观察到轻度软骨磨损。髌股关节软骨状况仍保持正常。在假手术组中，所有关节结构均保持正常，表明手术未造成不良影响。次全切组仅有部分软组织附着在残余半月板上，软骨退化明显。在空白PCL支架组，支架上可观察到一些不规则软组织存在，软骨发生侵蚀和缺损，内侧结外韧带上端附着部位的骨块愈合良好。

图3 3D打印半月板支架结合自体滑膜移植促进各向异性半月板再生

半月板由前至后分为三部分，包括前角、体部和后角。研究人员对每个部分的内区、中区和外区进行分析（图3A2）。在半月板次全切组中，只观察到一些疏松的纤维组织和纤维血管，GAGs较少。细胞主要由纺锤形的成纤维细胞组成。空白PCL支架组中，支架内可观察到一些纤维组织、纤维血管和较少的纤维软骨组织。新形成的组织与周围半月板结合较差。细胞成分中含有一些纺锤形的成纤维细胞和较少的椭圆形至圆形的软骨细胞。再生组织中可见血管。术后4个月时仍有PCL残留。PCL支架+滑膜移植组形成的纤维、纤维血管较少，而纤维软骨基质较多，具有不同数量的胶原和富含GAG的基质。再生组织由纺锤形的纤维母细胞样细胞和更多椭圆形至圆形的软骨细胞样细胞组成，再生组织中观察到了血管。接下来，对再生组织中COL I和COL II的沉积情况进行分析，在PCL支架+滑膜移植组中，再生组织中含有丰富的COL I和COL II。COL II基质主要分布在再生组织的内区和中区，与原生半月板相似，表明COL II呈各向异性分布。整个组织富含COL I，但主要分布在中外层，与原生半月板相似，表明 COL I呈各向异性分布。用双光子显微镜评估再生组织中胶原蛋白的含量。与半月板次全切组和空白PCL支架组相比，PCL支架+滑膜移植组再生组织的胶原蛋白含量更高，更接近于原生半月板的胶原蛋白含量。对原生半月板和再生组织的降低模量进行评估显示，半月板次全切组和空白PCL支架组的再生组织过于柔软，无法测量。PCL支架+滑膜移植组接近原生半月板的降低模量（35.25 ± 4.19 MPa）。此外，再生组织和原生半月板中均未出现COL10A1，表明半月板没有肥厚。血管造影显示，PCL支架+滑膜移植组的再生组织在术后2个月时血管丰富。术后4个月，血管含量明显减少。PCL支架+滑膜移植组的软骨磨损、蛋白多糖丢失较少，骨关节炎软骨组织病理评估系统（OARSI）评分较低，迷你猪在术后2个月和4个月内恢复正常步态。

图4 基质硬度对YAP-pSmad2/3-SOX9轴的影响

与术后2个月相比，PCL支架+滑膜移植组再生组织在术后4个月的机械性能明显增加。之前研究表明，基质硬度是影响YAP激活的另一个关键因素。研究人员假设基质硬度会影响YAP-pSmad2/3-SOX9轴。首先，为构建不同基质硬度条件，将人SMSCs接种到柔软的硅胶培养板或传统硬质聚苯乙烯培养板上。在硬质基质条件下培养后，YAP-pSmad2/3-SOX9轴被激活，YAP、pSmad2/3和SOX9表达上调，pYAP表达下调。人SMSCs表现出纤维软骨表型，COL I、COL II、凝集素和GAG表达上调。其次，先前研究表明Piezo1能感知基质的硬度。硬基质处理后，Piezo1的表达明显上调，随后下游钙调蛋白、钙调神经蛋白和去磷酸化NFATc1的表达也上调。因此，Piezo1可通过协同激活钙调蛋白和NFATc1来感知基质硬的程度，继而激活YAP-pSmad2/3-SOX9轴，促进人SMSCs生成纤维软骨。有综述表明，硬基质可通过整合素-FAK（局灶性粘附激酶）信号通路促进YAP的核转位和活化。本文研究发现发现整合素-FAK信号通路被显著激活，整合素α5（ITGA5）、FAK和磷酸化FAK（pFAK）表达上调。磷酸化LATS1则明显下调，导致YAP磷酸化减少。因此，硬质底物诱导的整合素-FAK信号激活抑制了Hippo信号转导，促进YAP的核转位和激活。最后，对PCL支架+滑膜移植组和原生猪半月板再生组织中FAK信号激活情况进行评估。再生细胞和原生猪半月板纤维软骨细胞FAK和pFAK表达明显升高。术后4个月时，再生细胞中FAK和pFAK的表达比术后2个月时有所增加。因此，以上结果表明，在半月板再生过程中，硬基质通过激活Piezo1和FAK信号调控YAP-pSmad2/3-SOX9轴发挥作用。

图5 生物力学和基质硬度通过Piezo1调节胶原交联酶（LOX和LH）的表达

胶原纤维交联程度是决定半月板机械性能的关键因素，赖氨酰氧化酶（LOX）和赖氨酰羟化酶（LH）是使胶原交联的主要酶。先前研究表明，Piezo1导致原生肌腱组织中胶原交联酶-LOX的上调。在此，研究人员假设Piezo1是半月板再生过程中胶原交联酶的上游。如前所述，在CTS或硬基质处理后，Piezo1在人SMSCs中上调。本文结果显示人SMSCs经CTS处理后，LOX和LH2（LH家族成员之一）的表达显著上调。LOX、LH1、LH2和LH3的mRNA均上调。此外，Piezo1激动剂-YODA1处理后，人SMSCs中LOX和LH的表达上调，而Piezo1拮抗剂-GsMTx-4处理后，LOX和LH的表达下调。因此，硬基质可上调人SMSCs中LOX和LH的表达。接着本文对PCL支架+滑膜移植组和原生猪半月板再生组织中LOX和LH2的表达进行了评估。再生组织和原生猪半月板LOX和LH2表达均明显升高。因此，生物力学特性和硬基质诱导Piezo1上调促进LOX和LH的表达，从而在半月板再生过程中催化胶原交联。

总结与展望
总之，本文利用转基因小鼠模型明确了间充质干细胞参与半月板的成熟和再生过程。在大型动物模型中，3D打印PCL支架结合自体滑膜移植促进各向异性半月板样组织再生，并保护软骨免于退化。从机制上讲，生物力学和基质硬度上调间充质干细胞中Piezo1的表达，促进钙离子内流和钙调素及NFATc1的协同激活，并进一步激活半月板再生过程中的YAP-pSmad2/3-SOX9轴。此外，Piezo1可上调间充质干细胞中LOX和LH的表达，从而催化胶原交联，增强再生组织的力学性能。因此，结合自体滑膜移植的3D打印生物仿真半月板支架将是一种有效的转化策略，可用于促进半月板再生。值得在临床上进一步研究。

文章来源：
https://www.science.org/doi/full ... Arid%3Acrossref.org