图案化纳米纤维膜+水凝胶制备生物3D打印人造皮肤替代品

来源： EFL生物3D打印与生物制造

生物3D打印在构建人造皮肤组织、复制天然皮肤的结构和功能方面具有优势。尽管许多研究表明打印皮肤替代品在伤口愈合中的效果有所改善，但使用水凝胶墨水制造具有复杂结构、模仿机械性能和适当细胞环境的生物3D打印结构仍然具有挑战性。

受胶原纳米纤维承受压力和调节细胞行为的启发，中国科学院深圳先进技术研究院赵晓丽团队将图案化的纳米纤维膜引入印刷水凝胶支架中，以制造复合人造皮肤替代品（CASS）。模仿胶原蛋白的纳米纤维膜有效提高了CASS的拉伸强度和抗断裂性，使其可缝合以牢固地植入皮肤缺损处。同时，图案化的纳米纤维膜还提供了引导细胞行为的生物线索。因此，CASS通过促进上皮再形成和胶原沉积，有效加速小鼠和猪模型中大面积皮肤缺损的再生（方案1）。

相关研究成果以“3D Bioprinting of Artificial Skin Substitute with Improved Mechanical Property and Regulated Cell Behavior through Integrating Patterned Nanofibrous Films”为题于2024年6月28日在线发表在《ACS Nano》上。

方案1  生物3D打印CASS及其在伤口愈合中的应用示意图

1. 混合水凝胶油墨的制备与表征

复合人造皮肤替代品（CASS）是通过在印刷水凝胶支架中引入图案化纳米纤维（PN）薄膜来使用仿生策略制备的。作者选择由明胶（Gel-MA）和透明质酸（HA-MA）组成的混合水凝胶作为印刷油墨，以模拟天然皮肤组织的化学成分。因此，首先研究了这种油墨的可印刷性和物理化学性质。通过流变测试、实际打印效果评估、降解速率评估、细胞实验和动态流变分析筛选出具有良好生物相容性和较高机械性能的G10H2凝胶（即Gel-MA浓度为10，HA-MA浓度为2）作为水凝胶油墨（图1）。

图1 杂化水凝胶油墨的表征

2. PN薄膜的制备和表征

PN薄膜旨在集成到CASS中，以改善其机械性能并提供胶原蛋白模拟生物线索。由于具有紧密堆积的纳米纤维结构的一般静电纺丝薄膜可能会阻碍细胞通过薄膜的迁移，因此构建了具有贯穿孔的图案化静电纺丝纳米纤维薄膜，这些薄膜通过静电纺丝收集在具有直径 2.0  mm贯穿孔的图案不锈钢板上（图 2A）。SEM、细胞实验说明P15G1.5-5薄膜（即聚乳酸-乙醇酸(PLGA)含量为15% w/v，Gel-MA含量为1.5% w/v，纺丝时间为5 min）允许人真皮成纤维细胞 （HDF）穿透孔隙到达培养皿，因此选择该薄膜进行后续实验，并将其命名为PN薄膜。

图2 PN膜的表征

3. PN薄膜增强复合人造真皮（CAD）的机械性能

通过打印具有梯度孔隙的水凝胶支架并将PN薄膜插入其中来构建CAD，以便从外到内模拟分层的天然皮肤组织，包括基底层、真皮和网状真皮。本文按照水凝胶-膜-水凝胶-膜-水凝胶的顺序，使用三个梯度水凝胶室和两个PN膜制备了一个简化模型（图3A）。在光学照片中观察到水凝胶室的梯度孔隙率（图3B）。CAD与水凝胶真皮（HAD）在拉伸应力下的对比表明，CAD的抗拉伸性远强于HAD。机械性能测试表明PN膜的插入有效地改善了CAD在拉伸应力、抗断裂性和耐缝性方面的力学性能（图3C-F）。此外，CAD可以缝合在裸鼠的皮肤上，为全层伤口提供全面覆盖，并紧紧附着在伤口边缘，类似于临床皮肤移植物（图3G）。

图3 复合人工真皮(CAD)的力学性能

4. 纳米纤维结构促进细胞粘附并调节细胞形态

PN薄膜还表现出模拟胶原蛋白的纳米纤维形态，并提供物理线索来指导细胞行为（图4A）。细胞实验说明PN薄膜提供了一个具有纳米纤维形态的平台，有利于细胞的快速粘附，并提供了模拟胶原蛋白的细胞环境（图4B-F）。差异表达基因显示PN薄膜的胶原模拟纳米纤维通过改变转录基因表达和细胞形态来影响HDF的行为（图4G-H）。  

图4 在凝胶切片和PN薄膜上接种的HDF的行为

5. CASS的构建

CASS由人工表皮层和人工真皮层组成。通过将两层PN薄膜整合到封装HDF的梯度打印水凝胶支架中来构建人工真皮。通过将人角质形成细胞 （HKC）接种到真皮表面形成人工表皮，并通过气液界面孵育成熟。HDFs和HKCs分别用绿色荧光（CFDA SE）和红色荧光（CMTPX）标记（图5A）。对荧光图像的分析显示，HKCs分布在支架表面，而HDFs分散在整个水凝胶丝中（图5B）。CASS孵育过程的照片显示，经过5天的浸没孵育和10天的气液界面培养，成功制备了具有表皮层的CASS（图5C-D）。HE、Masson染色和细胞角蛋白10（K10）荧光染色的图像观察到该表皮层的厚度从第5天的约20 μm增加到第15天的65 μm（图5E）。这些发现共同表明了HKCs的增殖和分化，从而证实了表皮层的成功构建。  

图5 CASS的制造

6. 小鼠和猪的伤口愈合试验

首先在小鼠模型中评估了CASS治疗大面积皮肤缺损的效果。伤口面积变化、HE 和 Masson 三色染色结果表明，HASS+Cell和CASS+Cell在封装的HDF和HKC的帮助下具有更强的促进伤口愈合的能力（图6）。  

图6 小鼠全层伤口的体内修复

为了进一步评估CASS在治疗全层伤口中的作用，使用四只Bama小型猪作为大型动物模型。在猪背上形成12个方形全层皮肤缺损（4厘米×4厘米），用CASS+Cell处理的伤口在术后第42天表现出优越的伤口愈合行为（图7）。   

图7 猪全层伤口的体内修复

综上，本文开发了一种具有梯度孔隙率和集成图案纳米纤维薄膜的3D生物打印CASS，以促进大面积皮肤缺损的伤口愈合。CASS具有优异的抗拉强度、抗断裂性和耐缝性，并在气液界面孵育后成功构建了表皮。在Balb/c裸鼠和Bama小型猪模型中，CASS有效加速了大面积皮肤缺损的再生，组织学分析表明，CASS治疗的伤口上皮化和胶原沉积效果更好。总之，3D生物打印CASS在治疗大面积皮肤缺损方面具有巨大潜力，纳米纤维膜在这项研究中的整合为构建具有卓越机械性能和合适细胞环境的生物打印结构提供了有益的策略。

文章来源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c04088