来源： EngineeringForLife
角膜是一种透明、无血管的组织，作为眼睛的前窗，对视力至关重要。角膜厚度的90%由高度有序的基质层组成，其中央厚度为470–500微米。基质层中的胶原纤维有两个显著特征：纤维较窄且具有物种特异性的相对均匀直径；胶原纤维以高度有序的横向排列。这种精确的胶原纤维板层的排列对于维持角膜的生物力学和光学特性（包括透明度）至关重要。在任何重大眼部损伤如深度切割、烧伤或感染的情况下，靠近Bowman膜的静止角膜细胞会发生凋亡，其他角膜细胞在分泌的白细胞介素、TGF-β和中性粒细胞分泌的刺激下被激活，并形成成纤维细胞和肌成纤维细胞，它们分泌异常和过量的ECM成分。这破坏了基质的有序纤维排列，导致角膜混浊。角膜失明的流行病学多样，并在很大程度上受特定地理位置眼病流行的影响。目前，尽管全球估计有2000万人患有角膜失明，但由于健康捐献者的严重短缺，只有1.5%的人受益于角膜移植。尽管面临未满足的临床需求、移植排斥和供体组织引起的感染等挑战，角膜移植仍然是恢复患者视力的黄金标准技术。因此，生物打印一种具有弹性且光学透明的角膜组织替代品仍然是一个挑战。
来自印度海得拉巴理工学院的 Falguni Pati团队引入了一种创新的方法，旨在增强丝素蛋白（SF）水凝胶的机械和光学特性，这对于角膜组织工程的发展至关重要。本文设计了一种独特的曙红Y基光引发剂系统，在绿光照射下，通过二酪氨酸键合高度浓缩的纯SF溶液。这一开创性的技术使得SF水凝胶通过二酪氨酸共价键得到加固，同时保持了卓越的透明度和柔软的弹性特质，避免了自发转变为硬而不透明的β-折叠构象。此外，本文将SF与脱细胞角膜基质（DCM）水凝胶结合使用，利用绿光下的光聚合和随后的热凝胶化来建立坚韧稳定的凝胶形成。由此产生的双交联混合水凝胶在机械强度和热稳定性方面优于双交联的DCM水凝胶。SF在DCM中的加入进一步增强了水凝胶的弹性和剪切恢复能力，使其成为角膜生物打印的理想生物墨水。在挤出打印过程中，生物墨水的光交联表层通过二酪氨酸键合加固了SF和DCM聚合物链，提供了初始的稳定性和机械强度。随后的后打印热凝胶化进一步通过自组装强化了胶原纤维链。值得注意的是，含有人类角膜缘间充质干细胞的生物打印角膜结构表现出透明度、结构完整性和最佳功能，这由角化细胞蛋白聚糖的表达所证明。总的来说，本文的工程化的3D构建体展现出在角膜组织工程中体内应用的前景，标志着该领域向前迈进了一大步。相关工作以题为“Bioprinting a resilient and transparent cornea stroma equivalent: harnessing dual crosslinking strategy with decellularized cornea matrix and silk fibroin hybrid”的文章发表在2024年12月04日的期刊《Biofabrication》。
【双交联DCM/SF杂化水凝胶的制备】
在交联的初始步骤中，曙红Y与其共引发剂TEA和共聚单体NVP一起被用来加快可见光基交联过程的凝胶化动力学。在可见光照射下，曙红Y转变为其三重态，从TEA中抽取氢原子并中和自身，从而产生TEA阳离子自由基。去质子的TEA通过在单体链中引发自由基中心来启动聚合反应，导致形成稳定的交联凝胶网络。图1(a)展示了DCM与SF混合过程及双交联机制的示意图。
图1 在丝素蛋白水凝胶中通过eosin Y介导的二酪氨酸键形成的机制示意图，以及DCM/SF混合水凝胶的双重交联示意图
【光引发剂与SF浓度的优化】
SF链主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，酪氨酸和其他氨基酸残基的含量极少。在本文中，SF溶液的交联通过二酪氨酸键实现。因此，丝中仅有5%的酪氨酸残基解释了为什么需要使用如此高浓度（18%）的丝溶液进行荧光素Y介导的交联。然而，将SF溶液的浓度降低到11%–12%会导致形成半交联的浆状凝胶，这些凝胶缺乏形状和结构保真度，即使在更高的光引发剂浓度下也是如此（图2(a)）。因此，足够的酪氨酸氨基酸残基的存在对于促进形成的酪氨酰自由基接近是至关重要的，这是形成二酪氨酸键所必需的。
图2 双重交联DCM和DCM/SF混合水凝胶的物理表征
【DCM和DCVM/SF混合水凝胶的透明度】
光交联增强了DCM水凝胶的透明度，而热交联则迅速自组装胶原蛋白链，导致凝胶半透明，这是因为阻碍了光的前向干涉并促进了背向散射。然而，光交联通过表层交联DCM链，防止了胶原蛋白自发组装。光交联的DCM水凝胶达到了约85%的透明度，而热凝胶化使透明度降低到约70%。另一方面，光交联的SF水凝胶表现出高透明度。将丝加入DCM水凝胶进一步提高了透明度，在双交联混合水凝胶中达到88%（图2(b)）。所有水凝胶支架的宏观图像如图3(c)所示，用于视觉上澄清透明度数据。
图3 双重交联DCM和DCM/SF混合水凝胶顶部种植或包埋hLMSCs的生物相容性
【SF、DCM和杂交水凝胶的粘度曲线与剪切恢复】
将SF加入到DCM水凝胶中后，观察到流变性质出现了有趣的变化。最初，90:10 DCM/SF杂交水凝胶的行为与DCM水凝胶相似，尽管在0.01 s−1的剪切速率下初始粘度略低，这可能是因为加入了10%（体积比）的SF。然而，当DCM水凝胶中SF的体积百分比从20%增加到30%时，其剪切稀化行为的程度有所降低。80:20（体积比）和70:30（体积比）的DCM/SF杂交水凝胶表现出触变性行为，介于DCM和18% SF水凝胶之间。这些水凝胶在高达1 s−1的剪切速率下显示出强烈的剪切稀化特性，超过这一速率后剪切稀化程度减少，并在100–1500 s−1的剪切速率范围内表现出牛顿流体行为。进一步增加剪切速率则导致剪切增稠特性。因此，SF的加入影响了DCM水凝胶的流变性质，影响程度随SF浓度的不同而异。然而，这种效应在90:10（体积比）DCM/SF杂交水凝胶中不太明显，主要是因为SF的添加量较少，偏离了DCM水凝胶的流变特性（图4(a)）。
除了粘度外，水凝胶在经历剪切应力后能否恢复到初始粘度对于保持打印结构的完整性至关重要。为评估这一点，对可双重交联的DCM和DCM/SF水凝胶进行了不同剪切速率下的测试，持续20秒，然后在移除剪切力后计算粘度恢复百分比。DCM水凝胶部分恢复了其初始粘度，分别在100 s−1、500 s−1和1000 s−1的剪切速率下观察到约50.5%和近70%的恢复。相比之下，DCM/SF水凝胶在所有三种不同的剪切速率下都表现出显著优于DCM水凝胶的剪切恢复性能，其初始粘度的恢复率在90%-94%之间（图4(b)）。这些发现强调了加入SF溶液对DCM水凝胶剪切恢复性质的有益影响。这种恢复潜力的提高表明，DCM/SF水凝胶可能在打印结构中提供更好的保真度，突显了这种杂交材料在各种应用中的潜力。
图4 流变分析与打印参数优化
【DCM和DCM/SF混合生物墨水的生物打印参数优化】
接下来，为了找到增加打印速度对细胞存活百分比的影响，本文使用hLMSC包裹的DCM和DCM/SF水凝胶，以1 mm s−1到50 mm s−1的不同速度打印了10 × 15毫米的片状结构（单层）。这些水凝胶经过双重交联处理，并在培养1天后进行死活检测（图5(a)–(d)）。在非常低的打印速度下，从1 mm s−1到5 mm s−1，两种水凝胶的细胞存活百分比最高，分别为86%到87%，但细胞在整个打印结构中随机分布。然而，随着打印速度从10 mm s−1增加到20 mm s−1，本文在打印的水凝胶片内观察到细胞呈图案化排列，两种水凝胶的细胞存活率均为80%–84%。在挤出打印过程中，施加剪切应力时，生物墨水聚合物在挤出过程中解缠结，被挤出后，聚合物链尝试重新取向流动方向，导致细胞包裹的聚合物丝束排列整齐。这种现象在较高的打印速度下更为显著。在25 mm s−1到30 mm s−1的打印速度下，细胞存活率下降到60%–70%，而在最高的40 mm s−1和50 mm s−1的打印速度下，两种水凝胶的细胞存活率急剧下降到50%（图5(c)和(d)）。因此，基于打印线条的保真度、细胞存活百分比以及水凝胶结构内细胞的图案化排列，本文将功能性角膜基质结构的生物打印窗口优化为20 mm s−1到25 mm s−1。
图5 打印参数优化
【角膜结构的生物打印及其特征描述】
在优化打印参数后，以22 mm s−1的速度和0.2 bar的压力使用330 µm的喷嘴生物打印了双层角膜结构。得到的12.6 × 12.8 mm的DCM和DCM/SF角膜结构表现出柔韧性，表明它们的弹性特性。通过摄影评估视觉清晰度，发现DCM和DCM/SF角膜结构显示出不同程度的透明度（图6(a)）。理想情况下，双层打印结构的厚度应约为660 µm。然而，由于生物墨水的扩散，实际双层打印结构的近似厚度为550–600 µm。使用纯净、高度浓缩的SF溶液进行角膜基质的生物打印时，以10 mm s−1的速度和极小的0.1 bar压力进行。所有结构均采用平行图案几何形状打印，其中SF角膜结构显示出最高的光学清晰度，其在700 nm处的透光率为90%。双重交联的DCM结构显示出80%的透明度，相当于DCM-pregel，而杂交角膜结构的透光率更高，达到87%（图6(b)）。
图6 生物打印角膜结构以及角膜结构的透明度对比
【生物打印角膜结构的免疫染色和RT-PCR】
为评估打印的角膜基质三维环境中hLMSCs的功能，本文进行了免疫荧光研究，检测了角化细胞核心蛋白，包括KS、KERA、LUM、CD34和ALDH3A1。DCM和DCM/SF生物打印角膜结构在培养第7天固定，并用这些标记蛋白染色（图7(a)）。结果显示，包埋在DCM和DCM/SF角膜结构中的hLMSCs均表现出高水平的KS、KERA和LUM表达。此外，hLMSCs在DCM和DCM/SF水凝胶中分化为角化细胞，通过角膜角化细胞特异性标记物CD34和ALDH3A1的表达来表明（图7(a)）。另外，使用鬼笔环肽染色可视化hLMSCs的形态，以观察细胞骨架F-肌动蛋白，而细胞核用DAPI染色。鬼笔环肽染色确认了包埋在生物打印结构中的hLMSCs的纺锤形形态（图7(a)）。图7(b)显示了鬼笔环肽、KS和DAPI的三重合并图像，用于DCM和DCM/SF角膜结构，证明了hLMSCs在DCM的类原生微环境中分化为角化细胞并表达了角化细胞核心蛋白。值得注意的是，DCM中加入SF并未影响hLMSCs的功能，因为未观察到表达水平的差异。2D对照（hLMSC在TCP中培养7天）的KERA和LUM免疫染色未显示出两种蛋白的任何显著表达。
图7 通过免疫染色检查包裹在DCM和DCM/SF生物墨水角膜结构中的hLMSC标记表达
此外，鬼笔环肽染色表明hLMSC的形态更广泛，这与包埋在生物打印结构中的hLMSC较长的纺锤形态不同（图7(c)）。阴性对照（无细胞的DCM-PCT和DCM/SF-PCT支架）也未显示出KERA和LUM的任何表达（图7(c)）。这些结果表明，DCM和DCM/SF角膜结构都提供了有利于hLMSC分化为角化细胞的环境，促进了角化细胞核心蛋白的表达。RT-PCR分析表明，DCM-PCT或DCM/SF-PCT生物打印结构中KERA的表达没有显著差异，而LUM在DCM-PCT中的表达略高于DCM/SF-PCT（图8）。在DCM中加入10%（V/V）的SF不会影响hLMSCs的功能，确保其在生物打印结构中有效分化。
图8 通过RT-PCR检测包裹在DCM和DCM/SF-PCT生物打印结构中的hLMSC的KERA和LUM表达
【总结与展望】
本研究介绍了一种利用曙红Y介导的可见光交联浓缩SF溶液的新方法，形成了具有卓越透明度和弹性的SF水凝胶，杨氏模量达到0.5 MPa。这些SF水凝胶表现出时间依赖性的硬化特性，同时保持显著的弹性属性。此外，本文将10%（体积/体积）的SF掺入DCM水凝胶中，并对混合水凝胶进行双交联处理：首先在绿光照射下进行5分钟的曙红Y介导交联，随后在37℃下进行热凝胶化以完成胶原纤维自组装。这种SF与DCM的协同整合以及双交联显著增强了DCM水凝胶的热性能和机械性能，应力-应变压缩曲线的断裂应变点左移，表明弹性强度增加。在双重交联的水凝胶表面种植hLMSCs后，细胞存活率达到了惊人的90%。为了将hLMSCs包裹在水凝胶内，本文调整了曙红Y的浓度并增加了DCM的浓度，以减轻细胞毒性的同时确保稳定的凝胶形成。光聚合提供了额外的优势，即表层交联聚合物链，使得这一过程高度兼容生物制造方法。最终生物打印出的角膜结构表现出坚固的结构完整性及最佳的角化细胞功能核心蛋白表达。总之，本文的SF掺入双交联方法为制造高透明、有弹性的角膜结构提供了一种有前景的方法，具有潜在的体内应用价值。
文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad9409
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