兰州大学研究团队在3D打印骨软骨方面取得进展

来源：高分子科学前沿 and 兰州大学

近年来，3D打印技术突飞猛进。相比于传统技术，3D打印技术更加精准和高效。它与普通的平面打印原理基本一致，只不过普通打印机内的“打印材料”是墨水和纸张，而3D打印机中是金属、塑料、细胞等实物，它将打印材料一层层叠加起来，最终把计算机上的蓝图变成立体的实物。

3D打印软骨可以用在修复人体软骨的缺损上，它不仅能修复病理性软骨缺损，而且能修复创伤性软骨缺损，所以3D打印软骨于治愈与软骨相关的重大疾病和维护人类健康而言具有重大意义。

虽然只是人体骨格连接处很小的一部分，但软骨却是人身体上不可或缺的重要组成部分，人的坐卧行走都需要它的参与。可是，因为软骨没有血管、神经及干细胞，所以不像人体其他组织具有自我修复的能力，想要修复只能依靠人为干预。

兰州大学口腔医学院范增杰教授及其团队充分利用3D打印这一新兴技术，联合美国康涅狄格大学化学与生物分子工程系SunLuyi教授团队，通过物理交联、光交联和化学交联三种交联方法首次设计并成功制备了一种三层梯度结构的软骨支架，日前，该研究成果以“3D打印羟基磷灰石梯度的水凝胶支架有效修复大鼠的骨软骨缺损”为题发表在 《先进功能材料》（AdvancedFunctionalMaterials）上。

国际独创

软骨修复必须有能够促使它自身分化的细胞，但是软骨细胞没有分化功能，必须让干细胞介入来使软骨拥有自我修复的能力，所以软骨修复一直是医学领域的研究重点和难点。

基于此，范增杰团队致力于设计出一种能够高度还原软骨组织的结构，这种结构能够诱导干细胞定向分化为软骨和骨细胞，从而在缺损的地方形成一个完整的软骨组织。

在刚开始构建软骨时，范增杰团队并没有想到引进3D立体技术，而是采用了传统的浸泡法。相较于3D打印技术，浸泡法流程更加复杂，“因为软骨组织本身很复杂”。

软骨细分为三层，最外层为软骨层，再往下一层是钙化层，最里面一层是软骨下骨层，这三层由外向内硬度依次递增，形成一个由软到硬逐渐过渡的梯度结构。同时，这三层的化学组成也存在差异，软骨层不含任何矿物质、全部由胶原纤维构成；钙化层含有30%左右的羟基磷灰石；软骨下骨层大概含有70%的羟基磷灰石，由此它们又形成了化学成分上的梯度结构。

要想修复软骨组织，就必须想办法恢复这三层组织。

传统的浸泡法需要分别泡三次水凝胶来模拟这三层。范增杰说：“浸泡法的前端需要先把水凝胶做出来，再放到模拟液里去泡。第一次泡低浓度的，第二次泡中浓度的，第三次泡高浓度的，这样软骨才能形成一个梯度。”通过浸泡法分别将每一层泡好后再把三层叠加，虽然也能达到3D打印技术的效果，但其制备流程繁杂，并且所用时间漫长、效率很低。另外，浸泡法还不能规避溶胀的弊端，“如果水凝胶材料泡水时间太长，它就会发生溶胀，一溶胀，它的尺寸稳定性就不那么好了。”

到底怎么样才能高效保质地模拟出软骨组织呢？范增杰及其团队将目光转向了3D打印技术，“因为3D打印技术具有提供高效精准的软骨组织修复方法的可能性。”

他们首先用电脑建模，把软骨的形状、大小都设计好，然后制备墨水，使用多头3D打印机来打印。第一个喷头不加羟基磷灰石，打印出软骨的第一层，第二个喷头打印钙化层，第三个打印软骨下骨层，一层一层叠起来，直到形成一个比较完善的软骨结构。由3D打印技术打印出的软骨组织有较低的溶胀率和较高的修复率，因此它能够更好地修复人体软骨缺损，“这在国际上完全是我们独创的”。

拨云见日
研究中，范增杰团队时刻关注着3D打印软骨技术在国际上的发展状况，他发现国际上在软骨打印方面存在一定弊端：“国际上现在依然没有办法同时模拟出两种梯度的软骨结构来，要么只有软骨的化学梯度结构，要么只有软硬梯度结构，还没有人能够做出同时具有两种梯度的软骨结构。”如前文所述，这主要是因为软骨的三层梯度所含有的化学成分不同而导致精准调控三层的化学比例难度很大，“国际上还没有办法在保证软硬梯度的同时兼顾化学梯度，而软骨的修复需要需要同时实现两方面的梯度结构。”

“看到国际上3D打印有局限性，所以我们就想再往前走一步，研究出一种同时实现软硬和化学这两方面的梯度结构的理论设计。”

实践过程可谓困难重重，“因为这方面是一个没有前人做过的工作，所以就没有可以参照的对象”。

团队面对的第一重困难便是打印墨水的制备，也就是打印软骨原材料的制备。墨水中有一种化学物质叫海藻酸钠，这种物质在打印过程中和氯化钙的钙离子反应从而容易产生团聚，团聚后的物质堵住打印所用注射器的针头，打印就无法正常进行下去，因此整个打印流程中最关键的一步就是打印墨水的制备。

为了解决这个令人头疼的问题，团队经过反复讨论终于想到了解决方法，他们在打印过程中增加了喷涂装置，这一装置能够延缓团聚的反应，“这是我们的创新做法，在原来基础上新建了喷涂装置，这是一个雾化装置，因为雾化比较缓慢，这样反应的时间就延长了，物质就不会很快团聚，也就不会堵住打印针头。”

团队面临的第二重困难是软骨如何成形的问题。刚开始打印软骨的时候没有想到用双网络结构，所以在往水凝胶中加羟基磷灰石的过程中，一旦其含量加到70%时，水凝胶系统就会发生坍塌，就像往果冻里注入其他物质会让果冻破碎一样，“所以如果没有双网络结构，整个软骨就无法成形。”

对于如何维持软骨理想的形态问题，范增杰团队的研究进程又一次陷入了瓶颈，原来单一的结构无法保持软骨形态的稳定性。为此，团队咨询了SunLuyi教授的意见，“孙教授提供了一些建设性、指导性的意见，他在材料性方面很专业，补充我们这方面的知识缺陷，双方优势互补。”

经过双方团队的深入探讨和共同努力，范增杰团队在原来的基础上引进了双网络结构。双网络有软硬两种结构，硬的结构起支架的作用，软的结构用来分散力量，“因为软的结构可以拉伸，遇到强力的时候，软的结构能够轻松将力分解掉，所以软硬兼有的双网络能够帮助软骨成形，并且让软骨拥有显著的力学性能。要做成软骨的话，水凝胶必须有好的力学性能，所以如果没有双网络结构，水凝胶会坍塌，很难保证最后打印出来的软骨形状”，范增杰说道。

研究人员的缺乏同样是团队面临的一大问题。团队主要由本科生和研究生组成，“学生需要首先保证课程学习，然后才能投身科研工作，如果有博士生，可能投入科研工作的时间精力就能更充足一些。但我们的学生都很努力，今年疫情期间学生基本也都没回家，一直在实验室加班加点赶项目进度。”

量身定“骨”

在范增杰团队的研究中，他们实现了根据软骨具体的缺损情况进行针对性建模打印，即根据病人软骨的缺损情况进行个性化建模，打出来的软骨完全符合缺损的形状，“3D打印技术一大优点就是个性化。每个病人软骨缺损的深度、形状和尺寸都不一样，我们可以直接运用3D技术先扫描他的缺损部分，然后再把他缺损的部分呈现出来，这是传统的浸泡法无法做到的。”浸泡法无法严格控制软骨的形状，这就会导致制备出的软骨的尺寸和实际缺损尺寸有较大误差。所以3D打印技术使整个软骨制作的制备过程效率得到显著提高：“以前浸泡法复杂的制备过程，现在3D打印一步就解决了。”

为了早日能够将打印出的软骨推广应用到人身上，团队首先在大鼠身上做实验。实验刚开始需要先在大鼠的骨头上磨开一个洞，之后将它软骨的三层结构都破坏掉，然后把打印好的软骨给它放进去，再进行缝合。“我们做了很多实验，测试过程中牺牲了好多老鼠，这个过程实际上来说是很长的，因为老鼠骨头重新长好至少需要三个月的时间。”三个月以后，通过肉眼观测和专业的MicroCT（微型CT）检测，团队发现大鼠的骨总量增加了，不仅长有软骨，而且长有硬骨，这个结果为以后应用于人体提供了很高的可能性。

接下来，团队致力于将3D打印软骨技术推广到人体应用上，范增杰说：“前期的动物实验已经做完了，我们已经在推进临床试验，未来可能会跟兰大一院、兰大二院合作。”

但3D软骨真正走向人体还需要漫长的过程，在这个过程中，需要经过国家的各项严格的实验和检测，这就要求3D技术要尽善尽美。

团队希望，未来3D技术能够达到硬骨和软骨缺损同步修复的效果：“现在3D打印在硬骨缺损方面做的比较多，但是在硬骨和软骨缺损一起修复的方面比较少。现在大部分软骨缺损的人不是表面一层软骨的创伤，而是软骨和下面的硬骨整个一起创伤。现在来说3D打印基本上是打印软骨的只打印软骨，打印硬骨的只打印硬骨，都没有把下边的硬骨和上面的软骨一起构建出来。现在我们团队有前期的工作基础了，未来希望能够完整打印出来一块既有软骨又有硬骨的骨组织。如果能打印出来，它的意义就非常大了。”

部分原文Figures:

图1.3D打印梯度支架修复大鼠骨软骨缺损的流程图。(A)电子喷雾装置。(a-c)分别为“0% nHA”、“40% nHA”和“70% nHA”墨水。(i)-(iii):骨软骨区的浅层(软骨)、中层(钙化软骨)和深层(软骨下骨)。( SA:海藻酸钠; CA:海藻酸钙; AM:丙烯酰胺; PAM:聚丙烯酰胺)。

该研究制备的三维支架由软骨层（纯水凝胶）、模拟钙化软骨的界面层（40/60%（w w-1）nHA/水凝胶）和模拟软骨下骨层的70/30%（w w-1）nHA/水凝胶底层组成，具有三层梯度结构，能够精确地与软骨、钙化软骨和软骨下骨的生物医学功能相匹配。具体的制备过程见图2。该过程可分为三个主要步骤：(1) 三种水凝胶墨水的制备；(2) 3D打印墨水；(3) 先后进行光交联和Ca2+交联。最重要的技术创新在于应用电子喷涂装置来控制Ca2+的缓慢释放以防止海藻酸钙的快速形成，这使得70/30%（w w-1）nHA/水凝胶层的打印成为可能。

图3.各种3D打印支架的照片。(A)从左至右分别为“0% nHA”、“40% nHA”、“70% nHA”(用罗丹明染成红色)和“G-nHA”。(B)3D打印人工半月板的模型: “0% nHA”(a)、 “40% nHA”(b)、“70% nHA”(c)和“G-nHA凝胶(d);(e&f)分别为浸泡在CaCl2溶液前后的图片。(C)进行拉伸测试的水凝胶支架:“0% nHA”(a)、“40% nHA”(b)、“70% nHA”(C)和“G-nHA”(d)的俯视图，以及(e)“G-nHA”支架的侧视图。

图4. 不同nHA/水凝胶质量比的支架材料的表征。A) FTIR光谱；B)XRD图谱；C)SEM图像；D)和E)不同支架的拉伸和压缩强度。

图5. 大鼠6周和12周后的骨软骨再生的大体观和微CT扫描图像。(红色矩形表示缺陷区域;白色箭头表示未完全降解的支架和骨样组织的混合物)

图6. 大鼠骨软骨再生的染色分析。(A-G)分别为对照组、BMSCs组、“G-nHA”组、“0% nHA+BMSCs”组、“40%nHA+BMSCs”组、“70%nHA+BMSCs”组、“G-NHA+BMSCs”组。(红色箭头:正常组织与再生组织的分界;黑色箭头:降解支架留下的缺损区域)