脱细胞基质水凝胶的生物制造技术及其应用

来源：生物打印与再生工程

脱细胞基质（Decellularized matrix，dECM）水凝胶是一种具有与天然组织器官近似复杂生化信号分子的亲水三维网络结构，被认为是组织器官修复/制造的理想材料。其主要成分包括蛋白质、糖胺聚糖、蛋白聚糖等，可以支持细胞3D培养、提供生化物理信号并与细胞动态互惠。近年来，该材料的成型加工是研究的热点之一，本专题主要总结了脱细胞基质在低维和三维结构的生物制造手技术与应用。

一、dECM的低维结构制造
研究表明dECM可为细胞重建组织特异性的细胞微环境，促进细胞功能成熟，因此常作为提高细胞生物相容性、调节细胞行为的功能性材料在低维结构中发挥重要作用。

1. Journal of Materials Chemistry B 2018：dECM涂层技术【1】
简介：
韩国浦项科技大学Dong-woo cho教授团队将猪胫骨前肌组织经1%十二烷基硫酸钠（SDS）、50U/ml DNAse、1U/ml RNAse和0.5%Triton X-100处理后制备得到肌肉脱细胞基质（mdECM），并溶解于含胃蛋白酶的0.5M醋酸中得到水凝胶前体（Pre-gel）。Pre-gel经中和后涂敷在由X射线LIGA技术制造的正弦波状（20、40、80mm）聚苯乙烯结构表面形成凝胶涂层，种植小鼠C2C12细胞培养7天后，评估肌管的形成情况。结果显示间距为80mm的正弦波状表面上观察到排列良好的肌管，并接近天然肌纤维的宽度（~100 mm）。dECM涂层表面细胞粘附、细胞活力、肌管形成和肌源性基因表达（提高1.5-2倍）水平显著高与胶原蛋白涂层。

2.  Composites Part B: Engineering 2022：dECM静电纺丝膜制造技术【2】
简介：
由于骨膜脱细胞基质（pdECM）的形状、完整性、均匀性和尺寸的控制难度较高，不能为临床骨缺损修复提供适合的治疗。基于此，广东省人民医院口腔科周苗教授团队把pdECM粉末溶解在六氟异丙醇中，利用同轴静电纺丝将聚己内酯（PCL）/pdECM复合制备出具有骨膜特异性生化信号分子和定制物理化学特性的组织工程骨膜（TEP）以促进骨缺损愈合。结果表明TEP具有良好的生物降解率，可避免感染、重建失败和影响新生组织长入等问题。与纯PCL相比，TEP可促进hBMDCs的增殖、基质成熟及成骨分化。与纯ECM相比，PCL核心可提供TEP较好的机械强度促进细胞的成骨分化并延长降解速率。

3. Macromolecular Bioscience 2022：dECM喷雾技术【3】
简介：
安卡拉大学Burak Derkus教授团队利用喷雾技术将骨脱细胞基质（bdECM）水凝胶前体溶液喷涂在聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）电纺膜上，置37℃孵育1h后取出电纺膜并清理多余的dECM材料。将人胎儿成骨细胞（hFOBs）种植在电纺膜表面，观察细胞行为。结果显示纤维定向排布并且喷涂dECM的PBAT电纺膜表面hFOBs的骨相关基因表达上调。

二、dECM的三维结构制造
目前生物3D打印技术是dECM三维结构制造的主流方式，以宏观构建仿生组织器官。但由于dECM凝胶时间长且成胶后机械性能较差，研究人员在3D打印过程中通过制造装置改进、制造工艺优化、制造原料加工等方式提高了dECM的打印性和打印后的形状保真度。

1. 制造装置改进
（1）Scientific Reports 2017【4】：改进3D打印机加热装置
简介：
韩国理工大学Jin-Hyung Shim教授团队开发了一种带双重加热模块的3D细胞打印系统，用于实时加热交联皮肤dECM（sdECM）生物墨水，实验表明sdECM水凝胶的黏度、模量及可打印性随浓度的提高而增加，而水凝胶孔隙大小与细胞活力随浓度升高而降低。当喷头和底板同时加热，sdECM的打印性显著提高，其中2%sdECM与2.5%sdECM的形状保真度无显著性差异，且同时加热打印得到的3D结构机械性能优于其他组。但长期加热打印会导致墨水干燥，会严重影响细胞活性和结构稳定性。

（2）Macromolecular Bioscience 2018【5】：预升温dECM交联后打印
简介：
萨班奇大学Bahattin Koc教授团队开发了牛跟腱dECM生物墨水，对比了不同增溶时间对dECM水凝胶模量、黏度的影响。打印时先将dECM水凝胶置37℃预热6分钟，然后采用微毛细管移取dECM水凝胶进行挤出打印，打印过程中无任何支持结构和/或额外的交联剂。该方法打印出的dECM微丝形状保真度较好，但层与层之间可能存在打印滞后及连接强度等问题。

2. 制造工艺优化
（1）Advanced Science 2019【6】：以海藻酸钠/黄原胶/葡萄糖内酯材料为悬浮体系
简介：
特拉维夫大学Tal Dvir教授团队将患者大网膜组织制备成dECM生物墨水，但在打印尺寸较大、复杂度较高的结构时发现dECM水凝胶弱机械性能难以支撑其重量，因此选用悬浮胶支撑dECM的3D结构，该悬浮胶主要由黄原胶和海藻酸钠微粒组成，且内部添加培养基。作为概念验证，他们设计了带主要血管的心脏简易结构，打印出的心脏结构完整性较好，可灌注，机械性能与脱细胞小鼠心脏无显著性差异，打印结构切片染色显示心肌结构及血管结构内部均匀分布心肌细胞与内皮细胞。

（2）Bioactive Materials 2022【7】：热塑性材料支撑dECM打印成形
简介：
韩国浦项科技大学Dong-woo cho教授团队利用3D细胞打印和骨/肌腱dECM生物墨水模拟肌腱-骨界面（TBI）制备了梯度多组织界面构建物。这些界面构建物在结构、成分和细胞异质性方面具有与天然TBI相似的梯度特征。打印时先成形PCL/PU聚合物支架，后将dECM生物墨水选择性沉积在聚合物支架表面，逐层打印获得8*3*1mm3的尺寸结构，然后进行体内外性能评估。实验结果表面该界面构建物在重建梯度界面和肩关节功能恢复方面具有优势，具有功能性肩袖再生的应用前景。

3. 制造原料加工
（1）Biomaterials 2016【8】：直接加工——核黄素修饰
简介：
无显著性差异，打印结构切片染色显示心肌结构及血管结构内部均匀分布心肌细胞与内皮细胞。韩国浦项科技大学Dong-woo cho教授团队开发了两步法，使用维生素B2诱导的UVA交联和热凝胶固化心肌dECM生物墨水，使dECM 3D打印生物结构成为可能。打印的生物结构内部细胞活力较高和且心脏祖细胞在内部可增殖分化。



（2）Biofabrication 2021【9】：直接加工——甲基丙烯酸化修饰
简介：
俄勒冈健康与科学大学Luiz E Bertassoni副教授团队合成了一种可光交联的人骨源性dECM水凝胶，以用于血管化支架的生物打印。他们将人骨碎片脱矿和脱细胞，获得骨dECM水凝胶前体，用甲基丙烯酸酐进一步处理修饰，获得光交联甲基丙烯酸化骨dECM水凝胶生物材料（BoneMA）。BoneMA具有可调谐的力学性能，其弹性模量随着光交联时间的增加而增加，同时保留了聚合物网络的纳米尺寸特征。3D打印的BoneMA支架支持内皮细胞的血管化，并在一天内形成相互连接的血管网络。此外，他们利用数字光处理（DLP）打印技术展示了BoneMA在微尺度的可打印性。

（3）Advanced Functional Materials 2021【10】：直接加工——钌/过硫酸钠修饰
简介：
韩国浦项科技大学Jinah Jang助理教授团队介绍了新型含钌/过硫酸钠（dERS）的光固化dECM生物墨水。利用dECM内含丰富的酪氨酸残基的优势，使其在可见光范围（400-450nm）实现快速交联，该光引发剂的使用浓度低，可防止紫外光诱导的细胞内DNA损伤，高渗透效率也有利于大尺寸结构的整体固化。该光固化体系在dECM生物墨水中具有巨大应用潜力，有效提高dECM生物墨水的打印精度和形状保真度。

（4）Polymers 2019【10】：间接加工——混合甲基丙烯酸化聚氨酯
简介：
中国医药大学附属医院3D打印医学研究中心谢明佑助理教授团队利用DLP技术制备了聚氨酯/聚多巴胺/细胞外基质（PU/PDA/dECM）神经导管，并评估了其物理特性、生物降解性、细胞相容性、神经相关生长因子、蛋白的分泌和表达，以及其在允许细胞粘附和增殖方面的潜力。结果表明，PU/PDA/dECM神经导管具有更强的亲水性，可促进细胞粘附、增殖、表达和分泌神经相关蛋白（I型胶原和层粘连蛋白），也可以增强神经源性蛋白的表达，如巢蛋白和微管相关蛋白2（MAP2）。此外，PU/PDA/ECM神经导管无细胞毒性，具有持续的生物降解性，并具有与PU导管相似的物理特性。因此，PU/PDA/ECM神经导管可能成为未来神经相关研究或临床应用的潜在候选材料。

（5）Applied Physics Reviews 2019【11】：间接加工——海藻酸钠/普朗尼克
简介：
韩国浦项科技大学Dong-woo cho教授团队利用血管来源dECM生物墨水和储蓄库辅助的三同轴细胞打印技术构建了血管移植物，该移植物尺寸大小与冠状动脉相似，并含有异质细胞分布，制备后移植入大鼠腹主动脉处探究其作为人工血管的可行性，结果表明所有植入物均显示出良好的通畅度、完整的内皮层、重塑的平滑肌和与宿主组织高匹配度。

（6）Acta Biomaterialia 2021【12】：间接加工——明胶/透明质酸/甘油辅助成型
简介：
维克森林大学再生医学研究所Sang Jin Lee教授团队分离猪耳廓软骨组织并进行脱细胞处理，随后利用甲基丙烯酸酐（cdECMMA）加工成光交联水凝胶，并与明胶/透明质酸/甘油混合提高其打印性，最后与软骨细胞混合以创建生物墨水。结果表明该混合生物墨水打印后的3D结构具有足够的力学性能和结构完整性，并且耳廓软骨细胞保持了活力、增殖能力且产生软骨ECM成分，包括胶原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）。

（7）Biomaterials 2022【13】：间接加工——PVA辅助产生对齐/定向纤维
简介：
维克森林大学再生医学研究所Geun Hyung Kim教授团队使用了脱细胞外基质（dECM）作为诱导细胞生化组分，并改进3D细胞打印过程，利用PVA辅助产生单轴对齐/定向纤维结构。打印结构中的成肌细胞与形成的肌管结构高度对齐，与基于甲基丙烯酸明胶（GelMA）的结构相比， dECM结构内基因表达水平增加了约1.5-1.8倍。

总结与展望
目前，脱细胞基质水凝胶已经过I期临床实验证明其生物安全性良好【14】，大量研究也证明其对细胞特异性分化的促进作用，有望成为组织再生和修复的优异材料。但其机械性能和成型能力限制了广泛应用，本篇文章旨在总结优化脱细胞基质成型加工能力的技术手段，调研结果说明，与单一材料相比，多组分材料的成型加工能力可提升范围更广，且具有可调谐的机械性能，是未来dECM生物墨水在3D结构构建中的发展方向。

参考文献
【1】Choi, Yeong-Jin, et al. Journal of Materials Chemistry B, 2018, 6(35): 5530–39.
【2】Li, Shuyi, et al. Composites Part B: Engineering, 2022,234: 109620
【3】Karakaya, Ece, et al. Macromolecular Bioscience, 2022: 2200303.
【4】Ahn, Geunseon, et al. Scientific Reports, 2017,7(1):8624.
【5】Toprakhisar, Burak, et al. Macromolecular Bioscience, 2018,18(10): 1800024.
【6】Noor, Nadav, et al. Advanced Science, 2019,6(11):1900344.
【7】Chae, Suhun, et al. Bioactive Materials, 2023,19 (1): 611–25.
【8】Jang, Jinah, et al. Acta Biomaterialia, 2016, 33 (3): 88–95.
【9】Parthiban, S Prakash, et al. Biofabrication 2021, 13(3):035031.
【10】Kim, Hyeonji, et al. Advanced Functional Materials 2021, 31(32): 2011252.
【11】Gao, Ge, et al. Applied Physics Reviews 2019,6(4): 041402.
【12】Visscher, Dafydd O, et al. Acta Biomaterialia, 2021, 121: 193–203.
【13】Kim, WonJin, et al. Biomaterials, 2022, 230: 119632.
【14】Traverse, Jay H, et al. JACC: Basic to Translational Science, 2019, 4(6): 659–69.