增加生物墨水异质性，提高3D打印质量和细胞活力

来源： EngineeringForLife

生物打印是一种不断发展的生物医学应用的通用技术。理想的生物墨水具有复杂的微环境，可以模拟人体组织，允许良好的打印质量，并提供打印后的高细胞活力。近日，来自德国卡尔斯鲁厄理工学院的Bruna R Maciel及其团队提出了两种在1-100μm长度尺度上增强明胶生物墨水的异质性，从而获得良好的打印质量和高细胞活力的策略。利用多粒子跟踪微流变学对膨胀水凝胶异质性进行全面的空间和微观力学表征。当将聚（乙烯醇）加入到均匀的明胶凝胶中时，由于微相分离而形成粘性夹杂物。这一现象导致了复杂3D结构的明显滑移和良好的打印质量，以及由于减少挤压过程中的剪切损伤，人肝细胞癌（HepG2）和正常的人真皮成纤维细胞（NHDF）具有高细胞活力。聚合物/纳米粘性团簇的形成降低凝胶断裂的临界应力，从而促进挤压，进而提高打印质量和细胞活力。通过微相分离在生物墨水中靶向引入微异质性是一种对具有高细胞活力的复杂结构高分辨率3D打印的有效技术。

相关研究内容以“Targeted micro-heterogeneity in bioinks allows for 3D printing of complex constructs with improved resolution and cell viability”为题于2023年8月21日发表在《Biofabrication》。

图1 细胞活力改善和生物墨水中微异质性引入之间的联系示意图

在挤压打印过程中，剪切力和细胞损伤之间存在明确关系。在挤压过程中，保护活细胞免受剪切变形和应力的影响，从而提高细胞存活率的策略包括形成塞状流或减少生物墨水的粘性变形（图1）。在本研究中，限制携带材料和活细胞之间的剪切力转移方法包括有针对性地引入生物墨水中的微异质性（图1）。

图2 微异质性特征

从MPT视频序列中获得的500张图像生成的叠加图像显示，纯明胶是一种均匀的水凝胶，示踪剂颗粒均匀地分散在6G样品中（图2A）。通过添加第二种聚合物（PVA），出现了离散孔状夹杂物形式的非均匀微观结构（图2B、C中的白色或绿色区域）。在白光显微镜获得的图像中可以观察到圆形的夹杂体（图2F，6G2P样品）。检测到的均方位移（MSDs）与时间无关，表明所有示踪剂都嵌入在明胶凝胶提供的弹性基质环境中，所有成分的局部弹性在10-25Pa范围内（图2G）。为了用PVA来表征凝胶的空隙空间，用注射器将示踪剂颗粒直接注入到内含物中（图2H）。MSDs随时间呈线性变化（图2I），表明示踪粒子在周围材料中自由扩散。第二种策略是加入纳米硅酸盐颗粒（Laponite-XLG XR），诱导形成密集排列的微异质性（图2D、E）。

图3 宏观流变学特征：滑移、剪切诱导的断裂和弹性

视频快照显示，当压缩样品时，聚合物溶液从凝胶中释放出来（图3A）。这种液相也导致样品在高剪应力下脱离平行板的几何形状，显示了样品6G4P在旋转流变仪测量过程中明显的壁面滑移行为（图3B）。在纯明胶凝胶和明胶/合成锂皂石复合材料（6G、6G0.2L、6G0.4L）中没有观察到这种明显的滑移行为，在压缩过程中没有发生液体溢出（图3F）。在高剪应力下会导致凝胶断裂（图3G)。6G、6G0.2L和6G0.4L凝胶的临界滑移应力值非常相似，τ s约为1000Pa（图3C）。在给定的剪应力下可以观察到明显的滑动行为，这些凝胶的滑动速度大约比纯明胶和混合凝胶高2个数量级（图3D）。图3E所示的凝胶和混合明胶/合成锂皂石凝胶（样品6G、6G0.2L、6G0.4L）的表观粘度曲线非常相似，表明合成锂皂石聚集体不影响凝胶的表观流动行为。单轴压缩试验显示，与纯凝胶和PVA样品相比，合成锂皂石凝胶的杨氏模量E明显下降（图3I）。本研究中提出的两种微观异质性形成策略的剪切弹性模量G0均有所增加（图3J）。

图4 挤压生物打印（EBB）：打印质量评价

当打印2D结构时，所有的凝胶都显示出原木桩几何形状（线宽< 1.5 mm）的高形状保真度（图4A-E）。一小部分粘性液滴或致密的粒子簇显示出明显改善、更薄的线质量（线宽< 0.6 mm，图4F）。人耳3D模型是一个复杂的物体，形状呈圆形，比简单的网格几何形状显示出更多的细节（图4G）。用样品6G2P在载玻片上方4mm处成功打印出了约58°的独立耳螺旋突出部分（图4H）。所有的打印结构都显示了高弹性剪切模量提供的机械稳定性（图4I）。

图5 3D生物打印：细胞活力

图6 3D生物打印：细胞活力

活/死试验显示（图5A-G），PVA水凝胶在第1天细胞活力高（图5D），而均质纯明胶水凝胶的活力明显较低。用水凝胶复合材料打印，细胞活力大于65%（图5H-K）。第1天嵌入HepG2细胞的样品显示在粘合玻片上的四层原木桩结构（图5L）。在样品6G、6G2P和6G0.2L中可以看到打印出的交叉区域的细节（图5M-O）。

以四层原木桩几何形状打印水凝胶，并在第1天分析细胞活力，以评估对3D打印的直接影响（图6A-C）和细胞培养7天的影响（图6E-G）。第1天，6G水凝胶细胞活力小于80%，而6G2P和6G0.2L凝胶的细胞活力大于85%（图6D）。第7天所有凝胶的细胞表现出相似的伸长。NHDF细胞更集中在水凝胶的边缘，所有样品的活力均大于90%。图6H中为样品6G2P打印在粘接玻片上的四层原木桩支架，在第1天嵌入NHDF细胞。样品6G2P第1天和第7天的打印的交叉区域以及丝之间的空隙区域的细节如图6I-L所示。综上所述，本研究开发了两种不同的具有定制微异质性的明胶生物墨水，可以制造复杂的3D结构，并显著提高打印质量和细胞活力。

在本研究中，具有微异质性的水凝胶允许在没有支撑材料的室温下3D打印独立的复杂结构，并在细胞培养7天后提供较高的NHDF细胞活力。MPT的微观结构表征可以为活细胞的3D打印提供良好的微环境条件。通过诱导明胶网络中粘性孔状内含物或聚合物-纳米粘性相互作用引起的微异质性形成来调节微观结构，对于打印质量和支持细胞3D打印的微环境发展具有重要意义。引入微异质性的概念以一种直接的方式转移到其他水凝胶系统中，从而刺激进一步的策略发展，以提高打印质量和细胞活力。

文章来源：https://orcid.org/0000-0001-7837-2582