香港城市大学胡金莲院士《AFM》：重组蜘蛛蛋白水凝胶用于生物3D打印和仿生细胞支架

来源： EngineeringForLife

重组蜘蛛蛋白为创造新的生物材料提供了许多可能性。然而，它们的多态性和易于聚集的特性在其生产和实际应用中都提出了挑战。香港城市大学胡金莲院士及其团队报道，突变重组蜘蛛蛋白在37°C和可见光照射下可快速、可控地形成水凝胶。在突变蜘蛛蛋白中，苯丙氨酸残基（F）被（GGX）重复序列中的酪氨酸残基（Y）取代，这有助于β-sheet的自组装和进一步形成淀粉样纳米原纤维。胶束/球状蜘蛛蛋白溶液转化为由纳米原纤维网络组成的蜘蛛蛋白水凝胶，随后通过双酪氨酸进一步交联。通过光谱学、透射电子显微镜（TEM）和分子动力学模拟验证其构象转变过程。此外，蜘蛛蛋白水凝胶根据其良好的生物相容性、剪切减薄性能和纳米原纤维网络结构，被用作生物墨水和仿生细胞支架。本研究结果揭示了蜘蛛蛋白的结构转化机制，并扩展其在生物医学工程中的应用。

相关研究内容以“Rapidly Forming Recombinant Miniature Spidroins Hydrogels Composed of Nanofibrils with Tunable Mechanical Properties for Bio 3D Printing and Biomimetic Cellular Scaffolds”为题于2024年12月26日发表在《Advanced Functional Materials》上。  

图1 工程重组微型蜘蛛蛋白示意图及其水凝胶形成机理

图2 蛋白质表达与分子动力学计算   

图3 水凝胶的制备和结构转化的表征

与蜘蛛蛋白相比，M-蜘蛛蛋白在凝胶形成过程中更容易从胶束/球中转化为β-sheet和淀粉样纳米原纤维，并可以通过双酪氨酸进一步交联（图1c-e）。为了保持蛋白质结构的完整性，本研究进行了一个保守突变，用酪氨酸（Y）取代MaSp2中的苯丙氨酸（F），设计的蜘蛛蛋白和突变蜘蛛蛋白的核心结构域序列如图1a所示。微型MaSp2由329个氨基酸组成，其中MaSp2结构域的一个重复区域位于NT和CT的两侧（图1b）。

设计的蛋白质由大肠杆菌（E. coli）生产，通过固定化金属亲和层析（IMAC）和尺寸排斥色谱柱进一步纯化，并通过SDS-PAGE进行表征（图2a）。蜘蛛蛋白和突变蜘蛛蛋白制剂的蛋白产率分别为116 ± 14和121±24mg L−1。由于突变，范德华力和静电相互作用更强，蛋白质倾向于自组装（图2e）。蜘蛛蛋白/M-蜘蛛蛋白水溶液可以在37℃下快速形成水凝胶，并通过蓝光进一步交联（图3a、b）。为研究蜘蛛蛋白在凝胶化过程中的结构转化，首先采用圆二色性（CD）。如图2b所示，M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白的CD光谱显示，在208和223 nm处出现强峰，表明蛋白质在所有温度下的构象主要是α-螺旋和随机螺旋结构。随着温度从10°C增加到70°C，两种蛋白开始展开螺旋，β-sheet的含量从4.15增加到17.61%（图2c）。蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白在4°C和37 °C水溶液中的快照如图2d、e所示。此外，还计算了不同温度下蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白中2个REP区域之间的定向平均相互作用自由能（图2f、g）。为深入了解M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白的结构转换过程，应用FTIR和XRD光谱对二级结构进行定量访问（图3c-j）。M-蜘蛛蛋白和蜘蛛蛋白在水溶液中都以直径为25 nm的球状或胶束的形式存在（图3k）。在37°C孵育1小时后，蜘蛛蛋白转化为淀粉样纳米原纤维并形成水凝胶（图3l、m）。交联的M-蜘蛛蛋白水凝胶表现为更长、更薄的纳米原纤维的聚集物（图3n）。   

图4 水凝胶的力学性能

渗透斜坡实验表明，蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白溶液的存储模量均随温度的升高而增加，而随着温度降低，存储模量没有下降到之前的值，但仍高于损失模量（图4a），表明形成一种热不可逆、稳定的水凝胶。此外，M-蜘蛛蛋白溶液可以在可见光控制下的2 min内形成水凝胶（图4b）。从SEM图像中观察到水凝胶的孔隙大小约为10μm（图4c、d）。在恒定频率为1rad s−1下进行的振荡振幅扫描显示，这些水凝胶样品在0.1-5%的应变范围内具有弹性。然而，当蛋白质浓度从150mg下降到50 mg mL−1时，线性粘弹性区域从9%转移到3%（图4e）。通过控制蛋白质的浓度，可以很容易调整水凝胶的机械强度（图4f）。与本研究结果相比，之前报道的凝胶化时间更长，凝胶化温度明显更高，并且所得到的水凝胶通常不透明（图4g）。

图5 蜘蛛蛋白水凝胶作为生物墨水和细胞支架的演示

本研究进一步证明了M-蜘蛛蛋白适用于生物技术应用（图5）。采用振荡剪切流变学分析方法，对M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白水凝胶在交联前的可打印性进行评价。所有浓度的水凝胶都表现出剪切变薄行为（图5a）。高应变振荡（200%）使水凝胶转变为更具粘性的状态（图5b）。基于剪切稀释和恢复性能，M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白水凝胶适用于3D打印，因此打印了支架，并根据针的尺寸、打印速度和压力等优化打印条件（图5c、d）。用小鼠胚胎纤维母细胞评价M-蜘蛛蛋白生物墨水的细胞活力和增殖能力。与商用的丝素纤维蛋白生物墨水相比（图5e-g），M-蜘蛛蛋白生物墨水具有更高的活力（>95%），并与丝素生物墨水一样增殖。然后将M-蜘蛛蛋白与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）混合，采用不同的处理方法制备生物墨水。四个小块和一个水凝胶的“CITYU”图案通过可见光固化（图5h）。“CITYU”水凝胶用CD31和Hoechst染色（图5i）。用Calcein/PI染色，共聚焦显微镜观察两种图案水凝胶。由于纳米纤维网络结构，培养5天后观察到90%以上的细胞活力（图5j）。对于生物3D生物打印，将细胞装入M-蜘蛛蛋白溶液中，在挤压前以37°C孵育60分钟，该支架由机械臂打印，并通过蓝光进一步固化（图5k）。免疫染色分析的结果证实HUVECs在第7天表达CD31（图5i-m）。以上结果表明，M-蜘蛛蛋白兼容不同的模式方法，并支持细胞的生长和增殖。   

全文小结
综上所述，本研究制备了一种基于结构转化的微型重组蜘蛛蛋白水凝胶，可应用于生物3D打印和细胞支架。揭示了凝胶化过程中蜘蛛蛋白构象转变的机理，并通过CD、FTIR、XRD谱、TEM和理论计算进行验证。高浓度的M-蜘蛛蛋白（胶束结构）可转化为淀粉样纳米原纤维，诱导水凝胶形成，并可通过双酪氨酸进一步交联。因此，M-蜘蛛蛋白可以非常迅速地形成水凝胶，交联水凝胶表现出可调的力学性能。此外，本研究还展示了M-蜘蛛蛋白作为生物墨水进行3D打印的应用，以及与ECM相似的纳米纤丝网络结构，可以促进细胞增殖。由结构转化衍生而来的M-蜘蛛蛋白水凝胶的概念为创建具有先进特性的功能化水凝胶提供可能性，可用于广泛的应用，如酶的锚定、可控药物释放和组织工程。

文章来源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202420059