该文章的作者是南极熊网友：中国生物3d打印机开发者刘博士。刘博士将从组织工程、生物制造、几种关键技术、生物3D打印输送系统等部分介绍。由于文章内容很充实，南极熊将以连载的形式给大家介绍。今天先来看目前常见的各种生物制造技术。
3D打印心脏：生物3D打印技术深入解读之一
3D打印心脏：生物3D打印技术深入解读之一
从组织工程到生物制造及生物3D打印
组织工程，又称之为“再生医学”，是一门用生命科学和工程学的原理和方法，利用生物材料和生物活性物质，体外培养或构建用于修复或提高组织器官功能替代物的技术。从1987年美国国家科学基金委员会提出“组织工程”的概念至今，已历经二十余年的发展。目前多种组织工程产品已经进入临床应用，尤其是厚度较小或无血供的组织，如皮肤、软骨、血管等，但复杂组织器官的构建和再造仍然面临巨大的挑战。 传统的组织工程三要素包括：种子细胞（cells）、支架（scaffold）和生长因子（growth factors）。最初的组织工程策略是将体外分离培养的种子细胞种植在合适的支架上，并在生长因子的环境下进行体外培养，培养成熟后，将细胞-支架复合体植入到体内，作为受损组织的替代物，以修复组织器官。 根据最初的设想，当细胞被置于支架材料时，细胞会在材料表面发生黏附、迁移、增殖和分化等行为，在特定信号因子作用下，发生细胞-细胞间的相互作用，且细胞会进行正常的生理活动，如分泌细胞外基质、营养代谢等，而支架材料会逐渐被细胞所分泌的代谢产物降解，在细胞-细胞相互作用和细胞-支架材料相互作用的联合效应下，最终形成由细胞和细胞分泌的外基质构成的组织。 最初，人们关注什么样的材料才能作为细胞增殖的外部环境，这种材料必须具有良好的细胞相容性，并且能够刺激细胞的正常生理功能，因此诞生了“生物材料”这门新兴的材料学分支学科。第一代生物材料来源于工业化的材料，主要为生物惰性材料，如医用钛合金、不锈钢等人工关节材料；二代生物材料典型特征为生物活性以及生物可降解材料，材料与人体组织能够发生可控的反应，并具有可控的降解性，如合成的聚合物材料以及天然生物材料等；三代生物材料则力求在分子水平上能够刺激细胞产生特殊应答反应，如诱导细胞增殖分化、细胞外基质的合成和组装等。生物材料已经取得了瞩目的成就，然而作为组织工程用的生物材料仍然面临很大限制。 最理想的生物材料是人体细胞的天然外基质，细胞外基质是一种成分和结构都极其复杂的纳米复合材料，包括10nm~几百纳米的胶原纤维、弹性纤维等结构蛋白，层黏连蛋白、纤连蛋白等功能蛋白以及糖胺聚糖（GAGs）和蛋白聚糖（PG）等多糖类，构成复杂的网状结构，且在外基质网络中分布着各种生长因子和信号分子以及特异性结合点位，这种诱导性的三维微环境（instructive 3Dmicro- environment）对细胞的生理功能起着非常重要的调节作用。然而迄今为止，人类仍然无法仿生地制备具有和天然细胞外基质相似成分和结构的生物材料。目前用于组织工程的材料可以分为天然生物材料和合成生物材料[ 5]。天然生物材料主要为蛋白和多糖类，如胶原、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、几丁质等；合成生物材料主要为高分子材料，其中研究最多的是脂肪族聚酯类，如PLA、PGA和PLGA等。天然生物材料的优点在于具有较好的生物相容性，但较难以实现材料的可控降解，材料性能一致性差，且机械性能较差；合成生物材料的优点在于其具有可控的降解性和机械性能，材料性能一致性较好，但生物相容性较差。生物材料的局限也使得组织工程的研究受到了很大的限制。 除了成分，材料结构对细胞功能的影响也不可忽略。组织工程支架是细胞生长的载体，最初人们对支架的性能要求包括： Ø 相互贯通的孔隙，合理的孔隙结构和尺寸，以便于细胞长入、营养物质的运输和代谢产物的排出，并为血管长入和血管化预留空间； Ø 高孔隙率以提高细胞种植密度； Ø 合适的机械性能以作为病损或受损组织的临时替代 Ø 合适的降解速率以匹配新生组织的生长； Ø 良好的生物相容性和支架表面化学性能，以有利于细胞的黏附、增殖和分化；
因此，传统的支架关注的是材料的宏观性能（macroscopicfeatures）以及机械性能与被修复组织器官的匹配性，然而随着研究的深入，仿生地构建具有和天然细胞外基质相似的纳米复合结构、重建细胞三维微环境对细胞的功能具有关键的影响。2005年发表于《Science》的文章指出，细胞在微米级的孔隙和纤维结构表面的黏附类似于二维表面的细胞黏附，细胞并非处于真正的三维环境下（由于材料孔隙和纤维尺寸与细胞尺寸为同一数量级），而纳米级的纤维结构能够提供更多的细胞黏附点位，更接近细胞真实的三维微环境（见下图1.1）。
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图1.1 细胞在微米级孔隙、微米级纤维支架和纳米纤维支架上的黏附
以往的研究表明，支架结构对细胞功能的影响是多尺度的，从纳米尺度、微米尺度到宏观孔隙结构均有重要影响。而支架的多尺度结构特征则有赖于所使用的制造技术，而生物制造则是一门致力于将生物材料（包括细胞）采用制造学的手段加工成为能够满足组织工程应用的特定三维结构的一门交叉学科。因此，组织工程的目标是制造修复病理或受损组织的替代物，而生物制造则为组织工程提供了丰富的制造和加工手段。
人体天然组织器官特征与生物制造技术概述
天然组织器官结构特征
通过对天然组织器官的解剖，可以发现天然组织呈现极其复杂的分级结构特征，其特点如下： 在纳米和亚微米尺度（10nm~1000nm）范围，具有成分复杂且呈现纳米复合结构的细胞外基质，前面已经提及，不再赘述； 在微米尺度（1μm~100μm）范围，广泛分布于组织内的毛细血管及微血管网络则处于该尺度范围内，对细胞的存活、氧气营养供应和物质代谢具有极其重要的意义，而构成生命的基本单元细胞的尺寸也在该尺度范围内； 在100μm~mm尺度范围，构成人体器官的基本结构单元则处于该尺度范围，如肺的肺泡，其直径为0.2mm，成人有3亿~4亿个肺泡；肾脏的肾单位，每侧肾由100万~150万个肾单位构成；此外还有肝脏的肝腺泡等，而这些功能单元对器官的生理功能起着决定性作用。此外，构成血管网络的小血管也在该尺度范围内； 在mm~cm尺度范围，组织器官的外部尺寸、中尺寸和大尺寸的血管均是处于该尺度范围内。 任一复杂组织器官都包含以上多种不同尺度的结构特征，除此之外，组织器官往往是由多种不同类型的细胞以有序的空间排列而构成。 总而言之，特定的多种细胞有序排列、复杂的分级血管网络、多尺度的组织结构特征、复杂的功能亚单元和复杂的组织器官外形都使得人工组织器官的构建面临极大的困难。
生物制造技术概述
目前，生物制造技术的发展已经能够部分解决前述挑战中的问题，尤其是随着纳米生物制造技术和生物三维打印技术等新兴制造技术的出现，复杂组织器官的人工构建已经不再遥不可及。 随着生物制造技术的发展和人们对于组织发育、伤口愈合等过程的了解越来越深入，形成了两类的组织工程路线，即： 基于支架的组织工程路线（scaffold-basedtissue engineering）——前面已提及组织工程对支架的要求，该技术路线的核心是制造理想的支架，这种支架能够促进细胞增殖和分化，并向组织器官发育，为人工组织器官的构建提供良好的外部环境。为此，支架的制造成为生物制造研究的重要方向之一，目前诞生了从纳米尺度、微米尺度再到宏观尺度的一大类支架制造技术，极大地推进了组织工程的研究进展。然而，迄今为止，该技术路线在构建复杂组织器官方面仍未取得突破。困难在于，种植在支架内的细胞密度不足，且分布难于控制，细胞能否自行迁移、聚集并向组织器官发育完全依赖于细胞-支架材料和细胞-细胞之间的相互作用以及细胞培养时所提供的微环境，然而究竟如何构建这种环境目前尚无定论。 无支架组织工程技术路线（scaffold-freetissue engineering）——该技术路线是受发育生物学的启发，人体胚胎在发育过程中，无需任何支架，即可形成各种组织器官。因此，在体外构建人工组织器官时，支架并非必须的。如果可以直接操纵细胞或细胞簇，将其精确沉积定位排列成为可以模拟人体天然组织器官的三维结构，则对于形成多种细胞的有序结构具有重要意义。所谓无支架组织工程就是不使用任何可降解的聚合物支架，直接利用细胞或细胞-生物材料单元构建人工组织器官的方法。典型的方法如细胞打印是直接将细胞单元打印成为三维结构。 下面将分别论述针对应用于两种技术路线的生物制造技术。
基于支架技术路线的生物制造技术
纳米生物制造技术
纳米生物制造技术的出现为仿生地构建具有类似细胞外基质的纳米纤维网络结构提供了可能。目前，制造纳米纤维网络支架的技术包括电纺丝技术、热致相分离技术和分子自组装技术。
（1）电纺丝技术 电纺丝技术是利用高压静电场的作用将生物材料溶液或熔体进行纺丝加工的技术（如下图1.2所示），生物材料微滴在电场力和表面张力的共同作用下形成“泰勒锥”，喷射流被迅速拉细，且溶剂快速挥发，最终在收集装置（平板或旋转收集装置）上形成纳米纤维网络。
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图1.2 电纺丝技术原理
电纺丝技术的优点在于其纺丝装置简易、成本低，而且材料适用范围非常广泛，凡是可以制备成溶液的合成高分子材料和天然生物材料均可以用电纺丝进行加工，是目前制备纳米纤维支架研究最多的技术。此外，电纺丝还可制备具有特殊结构的支架，如纤维定向排列、多材料多层复合结构、同心多材料复合纤维结构等，因此电纺丝工艺具有极高的灵活性。然而，其不足在于，其所沉积的纳米纤维直径比天然外基质中的纤维直径大，普遍在50nm以上；另外沉积的纳米纤维支架缺乏宏观孔隙，因此细胞难以长入到支架内部；此外可能存在的有机溶剂残留也可能对细胞生长不利。目前，电纺丝技术一般用于薄膜类或管状支架的制造，三维支架的制造仍然比较困难。 （2）分子自组装技术
分子自组装技术是分子在不受外力的作用下分子自行聚集、组织形成规则结构的现象，是自然界中普遍存在的现象。分子自组装主要是利用分子与分子或分子中某一片段与另一片段之间的分子识别，通过非共价键，如氢键、范德华力、π-π堆积以及亲水疏水等形成具有特定排列顺序的分子聚集体，是目前化学方向的前沿。在组织工程应用方面，研究最多的是两亲性（亲水疏水）多肽的自组装，多肽具有很好的细胞信号传导能力，且能够自组装成为纳米纤维结构，形成的纳米纤维直径最低可至10nm，能够较好地模拟外基质的纤维网络结构。此外，还可以在多肽中包含特定的功能性基序（如RGD序列，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列）以增加细胞的黏附。但这种方法涉及复杂的化学效应，且对纤维结构控制上的灵活性远逊于电纺丝技术。
（3）热致相分离技术 热致相分离也可以用于纳米纤维支架的制造，聚合物材料如PLLA等溶于有机溶剂后，降至低温时会发生热力学不稳定，从而分离成为两相：富聚合物相和穷聚合物相，通过冷冻干燥，溶剂相升华去除后，便获得仅由聚合物构成的纳米纤维支架。纳米纤维直径受到热致相分离过程中操作参数的影响，如聚合物溶液浓度和冷冻温度等。该方法是制备纳米纤维支架的简便方法，但其仅适合于结晶聚合物，同样对纳米纤维结构控制上的灵活性也不及电纺丝工艺。 上述提到的电纺丝、分子自组装和热致相分离都是用于制造纳米纤维基质，上述技术在模拟人体天然外基质方面已经取得了可喜的进展，而纳米生物制造的另外一个重要的研究方向是材料表面二维纳米形貌的制造。
（4）纳米表面形貌制造技术 大量的研究表明，支架材料的表面形貌对细胞功能具有重要的影响。如图1.3所示的材料表面形貌包括纳米沟槽、纳米凸起和纳米凹陷，可能对细胞形状、迁移、增殖和分化等产生重要的影响。比如，多种细胞在纳米沟槽表面会沿着沟槽方向排列并延伸，而在光滑的材料表面细胞则呈现圆形。这种效应表明，支架表面形貌对于支架设计和制造的重要性，将特定的表面纳米形貌包含到支架设计和制造中，对控制细胞功能可能具有重要意义。目前，用于制造表面纳米形貌的技术可分为两类：表面有序结构的制造和表面无序结构的制造。前者的技术包括：基于光刻或软光刻的图形复制技术和电子束光刻等；后者的技术包括：在材料表面用电纺丝等技术沉积纳米纤维和材料表面化学处理等。
然而，目前面临的挑战在于表面形貌的制造目前仅能用于二维基底，在三维支架中制造表面纳米形貌仍然非常困难，但将其作为三维支架设计的重要考虑因素是未来的发展方向。
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图1.3 材料表面纳米形貌以及细胞在材料表面的反应 微尺度生物制造技术
在该尺度范围内，急需解决的问题就是血管化的问题。在人体内，氧、营养物质和代谢产物等的交换是靠扩散进行的，然而扩散的有效距离仅为100~ 200μm，厚度大于几百微米的组织都需要一套血管网来支撑细胞的生理活动。人工组织体外培养时，可以通过灌流灌注的生物反应器为其提供氧气和营养物质，而当植入体内后，细胞必须依靠附近的毛细血管来提供，因此血管化对人工组织的存活起着关键作用。组织的血管化是靠宿主的血管长入到人工组织实现的，然而这种方式的问题在于血管化的速率太慢（每天仅几十微米），这样就会导致人工组织内的细胞死亡，从而导致修复失败，如何实现快速血管化已经极大地限制了组织工程的发展。 目前实现血管化的方法主要包括如下几种： Ø 支架设计——在支架中设计尺寸大于250μm的孔隙，并提高孔隙相互贯通性，从而使得宿主血管能更好地长入植入体，提高血管化的速率，但该方法仍然有赖于宿主血管的长入； Ø 缓释促血管化因子——如血管内皮生长因子VEGF和成纤维细胞生子bFGF，可提高血管化速率； Ø 体外预血管化——当血管内皮细胞与支架在合适的条件下进行体外培养时，会形成类血管结构，从而形成预血管化网络，这样在支架植入体内后，无需完全依赖宿主血管的长入来生成血管网，从而加速血管化进程； Ø 体内预血管化——将植入体通过显微手术植入到体内血供充足的合适部位，利用体内生理环境进行预血管化，初步形成微血管网络，然后将植入体取出，再植入到待修复的部位。 尽管以上的方法均可加速植入体的血管化进程，但都有比较明显的局限，目前还没有哪种方法能够完全解决血管化的问题。 与此同时，微制造技术（microfabrication）由于其可以制造亚微米~微米级的结构，在制造血管网尤其是模拟毛细血管网方面体现出一定的优势。 （1） 模型复制+叠层技术（replica molding coupled withlamination）
来源于MEMS技术的微加工技术可以用来制造含有毛细管网的微流体装置，主要是基于光刻和软光刻技术。但传统的光刻和软光刻技术不能直接用于生物微流体装置的加工，必须进行适当的调整。迄今为止，包括PDMS（聚二甲基硅氧烷）、PLGA（乳酸-乙醇酸共聚物）、PCL（聚己内酯）、PGS（Poly(glycerol sebacate)）以及天然高分子材料如明胶、海藻酸钠、丝素蛋白和琼脂等多种材料已经可以被加工成为微流体装置。所谓的模型复制就是将光刻的微图案复制转移到被加工的材料上的过程。 图1.4所示为PLGA微流体装置的制造过程，通过光刻工艺在硅晶圆表面加工出微结构，然后将PDMS浇铸在硅模上，从而获得PDMS模（图1.4A），然后再将PLGA熔体浇铸在PDMS模上，PDMS上下模固定在刚性金属板上，该过程类似于模锻工艺，在恒定的压力下压制，冷却后即可获得PLGA微结构（图1.4B），然后再将含有微管网结构的PLGA材料与光滑的平面PLGA材料通过加热加压后结合在一起，从而形成单层PLGA微流体管网（图1.4C）。复杂的微流体网络可以根据人体循环系统特征和计算流体结果，采用MATLAB等软件设计，通过层层叠加即可制造多层微流体装置。 图1.4 PLGA微流体装置的制造过程及微流体装置
这种技术的优点在于其具有很好的结构分辨率（可至100nm）和设计灵活性，在模拟毛细血管网结构和人体循环系统流体特性上具有无可比拟的优势，对于体外重建细胞微环境有重要意义。该技术在微流体细胞培养、生物芯片和药物研发等方面具有非常广泛的应用前景。但作为可植入人体的组织工程产品，该技术仍然面临很多限制，如三维的微流体装置必须通过层层叠加制造，因此制造个性化、外形复杂的三维结构比较困难，此外，如何将微流体管道与人体循环系统连接起来也面临较大困难。
（1） 微立体光刻（microstereolithography, μ-SLA，微光固化） 在传统的立体光刻中，液体腔中盛满液态的光敏树脂，在紫外激光照射作用下，液态树脂会发生交联固化，从而由液态转变为固态，在计算机的控制下层层扫描制造树脂零件，该工艺的零件分辨率一般为150μm。所谓微立体光刻是通过改进系统的设计和光敏树脂特性，将工艺分辨率提高至低于5μm的水平，而决定工艺分辨率的取决于在紫外激光照射下发生交联反应的液态树脂的体积，因此，必须大幅提高工艺的扫描平面内的分辨率和高度方向的分辨率才有可能实现微光固化。 光敏树脂从液态至固态的转变存在一个门槛值（单位体积吸收的光子数量），该门槛值是由光子吸收速率和辐照时间决定的，制造过程中单层材料固化的厚度就决定了高度方向的分辨率，为降低固化层的厚度，可以减小辐照的时间使得更薄的材料固化，但当入射激光能量波动时会导致工艺稳定性很差；而采用高吸收率的反应介质可有效降低光在树脂中穿透的深度，从而有效降低固化层厚度。水平分辨率的高则可已通过更好的聚焦系统，减小激光斑点直径，从而减小固化材料的线宽。
目前，微立体光刻系统可以分为三类：线扫描式微立体光刻、面投影式微立体光刻和基于双光子聚合的微立体光刻。尤其是基于双光子聚合的微立体光刻，其分辨率可至100nm，由于其无可比拟的分辨率，也引起了组织工程研究人员的兴趣。如Harvard Univ.的P. Tayalia等人采用双光子聚合制造了不同孔隙大小和结构的三维支架，用于研究二维和三维支架中细胞迁移行为的差别。图1.5为采用微立体光刻技术制造的组织工程支架。 图1.5 双光子聚合工艺制造的微型组织工程支架，a)材料为SR610，b)材料为ORMOCER®, 500×500×300μm3,c)PEG-DA 微立体光刻技术最大的局限在于其材料体系中必须引入光引发剂，而往往光引发剂和液态单体是有细胞毒性的，尽管单体聚合后的材料具有较好的生物相容性，但未聚合的液态单体和光引发剂的残留会对支架的生物相容性造成不利的影响，但微立体光刻作为一种极高成形精度的制造工艺，未来在支架制造方面具有较好的应用前景。
（3）压力驱动微注射沉积（pressure activatedmicrosyringe deposition）
该工艺最早由Vozzi等人提出，其在不锈钢注射器的头部安装直径为5μm~20μm的毛细玻璃针管，材料在过滤的压缩空气作用下喷射，该技术与传统的基于液体喷射的技术非常类似，但是由于其安装的玻璃针管的直径较小，因此喷出的微丝直径可达到10μm以下。但该技术的问题在于，其仅能喷射粘度较低的生物材料，难于成形粘度较高的生物材料和水凝胶，限制了该工艺的应用。 图1.6 PAM工艺示意图 生物三维打印技术（2D/3D Bioprinting） 三维打印技术是上世纪80年代末兴起的一种新型制造技术，最初被称为快速原型技术（rapid prototyping），目前学名为增材制造技术（additive manufacturing）。三维打印由于其可以直接将所设计的计算机三维模型通过离散堆积的制造原理加工成为实体模型，具有极高的设计和加工灵活性。
组织工程产品（包括支架）由于其对个性化要求极高，因此非常适合于用三维打印的方法来进行加工。生物三维打印就是采用三维打印的原理将生物材料层层堆积成为三维结构的一类技术，通过对传统的三维打印技术进行一定的改进即可实现生物三维打印。
（1） 熔融沉积技术（fused deposition modeling，FDM） 最初的FDM技术是将ABS树脂加热熔融后挤出（200℃以上），层层打印为三维物体。该技术的特点为需要将材料制备成丝状，如图1.7所示为PCL丝材（熔点为60℃）可以被打印成为三维支架。这种技术的缺点在于：材料必须为丝材，而往往生物材料为粉末或溶液；此外，加热熔融可能会造成某些材料的变性，对生物相容性产生影响。
（2） 光固化成形（stereolithography，SLA） 光固化是最早被研究的三维打印技术，也是目前所有三维打印工艺中精度最高的一种。然而该工艺仅适用于在紫外光照射下可发生聚合反应的材料，而往往这种材料不具有生物相容性和生物可降解性，为此必须基于现有的生物材料制备合成可光固化的材料体系，与微立体光刻技术相同，有毒的液态单体和光引发剂的残留会影响支架的生物相容性。
（3） 选择性激光烧结（selective laser sintering，SLS） 该技术是用激光产生的热量熔化粉末床上的粉末，层层扫描堆积制造。凡是可以被激光加热熔融并被制备成为粉末原料的材料均可以用SLS工艺成形，如PCL、PLA、PCL/TCP复合材料、HA和13-93生物活性玻璃等。该技术的问题与FDM工艺一样，材料在高温下的熔融可能对导致聚合物性能的改变，降低材料的生物相容性。
（4） 三维印刷工艺（three-dimensional printing）
最早的三维印刷工艺是由MIT提出的，其采用喷射的粘接剂使粉末颗粒粘接起来制造三维结构，对生物材料而言，则必须选择合适的粘接剂，这种粘接剂不能影响支架的生物相容性。 图1.7 三维打印技术应用于支架制造 以上的各种工艺均是基于传统的三维打印工艺改进而来，在某些方面均面临着较大的限制，尤其是材料适用的广泛性、加工过程对材料的破坏程度等，为此由清华大学提出的低温沉积制造技术则有效地避免了上述问题，成为一种较为理想的支架制造方法。
（1） 低温沉积制造技术 低温制造的成形原理为生物材料与某种溶剂混合后形成均相溶液，然后通过挤压喷射的方式喷射至溶剂的凝固点温度以下，在材料喷射过程中发生相分离，形成富聚合物相和穷聚合物两相，溶剂的结晶可辅助结构的成形。成形完毕后，将制造的支架放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，在低温真空的环境下，溶剂升华后留下仅由生物材料构成的支架。 该工艺的优点在于将热致相分离技术与三维打印技术有效地结合在一起，既有三维打印技术的灵活性，又可包含相分离过程形成的微米甚至纳米孔隙结构，因此在制造分级孔隙制造方面具有无可比拟的优势。
此外，该技术适用材料范围广泛，只要材料能与某种溶剂混合且在低温下能够发生结晶，且材料在喷射过程中结构不会被破坏，即可用低温沉积技术来制造支架。目前，已经探索过的材料体系包括：PLA、PGA、PLGA和有机1,4二氧六环体系，明胶、海藻酸钠、壳聚糖和水体系以及胶原和稀酸溶液体系，在上述溶液体系中还可加入钙磷盐粉末制备成为悬液作为原料。因此，低温沉积制造技术是组织工程支架较为理想的制造技术。 图1.8 低温沉积制造工艺 受到材料喷射手段和加工工艺的限制，目前基于三维打印的组织工程支架制造技术的精度均在100μm以上，因此无法用于制造类似血管网的精细结构，不断地提高成形精度仍是有必要的。
传统的支架制造技术
传统的支架制造技术包括：溶剂浇铸+粒子析出法、致孔剂析出法、气体发泡法、纤维连接法等，但这些技术无法控制材料的孔隙大小和相互贯通性，目前的研究已经不多。 多尺度支架制造
前面根据技术所处的尺度范围综述了各类支架制造技术，这些技术均在某一方面具有其它技术不可替代的优势，因此本质上来讲这些技术之间并非替代关系。理想的支架应具备宏观-微观-纳米多尺度的孔隙结构（macroporous-microporous-nanoporouscombined），这种支架具有个性化的外形以适应组织缺损形状、可控的贯通宏观孔隙形状和大小以适应细胞和血管长入、微观孔隙以促进营养物质交换和代谢产物排出、纳米纤维网络结构以模拟人体天然外基质，而单独一种技术难以产生所需的结构。因此，未来的趋势应是结合多种技术制造具有多尺度结构特征的仿生支架。比如，低温沉积制造技术就是将热致相分离和三维打印技术相结合。 面向无支架技术路线的生物制造技术 在基于支架的组织工程技术路线中，支架是实现细胞向组织转变的桥梁和核心，但基于支架的技术路线存在细胞种植密度不足、细胞在支架内的分布无法控制，难以形成天然组织特有的细胞有序排列等缺点。为此，提出了无支架技术路线，无支架技术路线不使用生物材料支架作为细胞培养的载体，而是直接操纵细胞，将细胞看做一种特殊的“材料单元”，采用受控组装或打印的方法直接将细胞装配成为特定的二维或三维结构，然后利用细胞所具有的自组装行为，实现从细胞向组织的发育。目前，根据所操纵的细胞单元类型，已经被探讨的方法可以划分为（图1.9所示）： Ø 单细胞作为装配单元（single cells as building blocks） Ø 细胞微滴作为装配单元（microdroplets of cells as building blocks） Ø 细胞微组织作为装配单元（multicellular microtissue as building blocks） Ø 细胞-水凝胶微丝作为装配单元（cell-ladenhydrogels as builing blocks） Ø 细胞二维层片作为装配单元（2D cell sheets as building blocks） 图1.9 无支架组织工程技术路线，a) 单细胞作为装配单元，b) 细胞微滴作为装配单元，c) 组织微球作为装配单元，d) 细胞-水凝胶微丝作为装配单元，e) 二维细胞层片作为装配单元
单细胞作为装配单元 单细胞的精确定位沉积对于形成精确的细胞排列来模拟人体天然组织的有序结构很有意义。目前，可以实现单细胞排列的技术包括：激光导引直写技术（laser-guided direct writing of cells）和单细胞打印技术（single cell printing）。 激光导引直写技术是DavidJ. Odde等人于2000年提出，其利用弱聚焦的激光（波长约为800nm）捕获并利用光学力搬运细胞将细胞导引至接收基底上的技术，该技术具有极高的分辨率，可实现单细胞的精确定位沉积以制造细胞平面阵列，但其缺点在于导引距离小，效率低（每小时仅导引几十~几百个细胞），难于形成三维结构，在组织工程领域的应用有限。 单细胞打印技术是基于目前的喷墨打印技术改造而来。2010年，德国Freiburg大学联合其它六家欧洲研究机构发起了一项单细胞打印技术的研究，由欧共体资助300万欧元，该项目命名为PASCA（platform for andvanced single cellmanipulation and analysis）。该项目研发了一台单细胞打印机，其基于微流体芯片利用流体聚焦原理，并利用压电晶体喷射实现微滴的离散打印，在打印过程中利用光学检测手段判断喷射的微滴中是否仅含有单个细胞，若不含细胞或多于一个细胞则该微滴不被打印至基底上。事实上，这种方式并非完全可靠，被打印的微滴中可能不含细胞，也可能多于一个细胞，但总体而言，根据其报道的数据，含单细胞的微滴比例为80%左右。与激光导引直写技术相比，单细胞打印的效率大大提高，非常适合于打印二维细胞阵列。 总体来讲，用单细胞作为装配单元，近期的研究目标以二维细胞阵列结构为主，用于细胞生物学研究细胞-细胞相互作用、疾病诊断或药物测试领域，用于构建三维组织仍然非常困难。一般用于修复的人工组织包含的细胞至少上千万，时间成本也难以承受。
细胞微滴作为装配单元 所谓细胞微滴是指包含在微滴中的细胞数量多于一个，往往为3~10个，打印的细胞微滴尺寸为数十微米~一百微米，这样打印的效率有所提高，但打印精度随之降低。目前实现细胞微滴打印的技术主要有三种：细胞微滴喷墨打印、激光打印和微阀打印技术。 通过改造商用的喷墨打印机，Boland等人将细胞悬液代替墨滴，成功地将细胞打印至水凝胶基底，并保证细胞有一定的存活率。激光打印技术是利用入射激光的热作用使得材料微滴从打印层转移到基底上，而微阀打印是利用微电磁阀的开关形成打印微滴。上述几种方法的共同特征在于微滴的细胞数量是无法控制的，取决于打印速率和细胞悬液内的细胞密度等参数。
与单细胞打印相同，如何将离散的微滴组装成为三维结构以制造人工组织仍然是这些技术面临的挑战。
细胞微组织作为装配单元
这种细胞微组织实际上是细胞团簇，可以包含一种或多种细胞类型，一般为球状或圆柱状，可以用离心法从细胞悬液制备，直径一般为几百微米，制备的微组织作为原料，用生物三维技术将其打印在水凝胶基底上，按照特定的三维结构排列起来，此后这些微组织会融合为一体，从而形成宏观组织。目前，这种技术已经用于血管的制造，主要由Univ. of Missouri的Gabor Forgacs等人提出，目前已经成立了器官打印公司organovo致力于将该技术产业化。
细胞-水凝胶微丝作为装配单元
该技术是将细胞与外基质材料连续挤出，形成微丝单元，利用三维打印的技术层层堆积加工成为细胞三维结构体。由清华大学提出的细胞三维受控组装便是属于此类技术，该技术非常适合于构建大尺寸的宏观三维组织，而且不存在前述微组织后续的融合过程，但该技术目前所喷出的微丝直径在200μm以上，难以模拟精细的组织结构如毛细血管网。 图1.10 细胞三维受控组装技术
细胞层片作为装配单元 该技术的关键在于如何获得由细胞和外基质构成的二维层片。最早Auger等人将人体血管平滑肌细胞和成纤维细胞分别在加入了抗坏血酸的培养基中培养，细胞在抗坏血酸的环境下会大量地进行细胞外基质的内源性合成，30天之后即可获得一层由细胞和细胞所分泌的外基质构成的细胞层片，然后该层片裹在圆柱状的支撑上，即可获得管状结构。
Teruo Okano等人在细胞培养皿表面添加一层N-异丙基丙烯酰胺单体，培养皿表面经电子束照射后会以共价交联的方式固定在培养皿表面，这种材料在温度变化的作用下发生亲水/疏水性转变，当温度低于32℃时，培养表面呈现亲水性，当温度高于32℃时，培养表面则会变为疏水性。首先在37℃下培养细胞，细胞贴附在培养表面并增殖形成一层细胞层片，然后降温至20℃，细胞层片则会与培养表面分离，从而获得细胞层片。细胞层片可以直接用于移植，特别适合于薄膜类组织，未来如何操纵二维的细胞层片来制造包含血管网的复杂三维组织仍需进一步研究。
装配单元类型选择与对比
前面论述了利用细胞或细胞-材料单元构建二维或三维结构的方法，装配单元类型的选择主要从装配精度、效率、制造三维结构难易程度以及多种类型细胞受控排列难易程度等加以考虑（如表1.1所示）。不难看出，单细胞装配具有最高的精度，但装配效率低且难以制造三维结构；细胞微滴装配精度有所降低，效率有所提高，仍难以制造三维结构；微组织和材料微丝单元具有较高的装配效率，且易于构建三维结构，但精度较低；二维细胞层片也具有较高的效率，但较难于制造三维结构。
表1.1 装配单元类型比较
| | | | | | 单细胞 | 5μm | 低 | 困难 | 较容易 | | 细胞微滴 | 10~100μm | 较低 | 困难 | 较容易 | | 微组织 | 100~500μm | 较高 | 较容易 | 较容易 | | 细胞-材料微丝 | 200~500μm | 高 | 容易 | 较容易 | | | | | |
此外，还需考虑的一个重要问题是：由细胞或细胞-材料单元装配后的结构在体外培养过程中，细胞会迁移、增殖和分化，并分泌细胞外基质，细胞自身的生理活动如何影响装配后的结构？细胞对结构的重塑（remodeling）会导致细胞重新排列分布，从而丧失了原有装配过程中细胞所具有的定位精度，因此初始装配精度的效果和必要性必然会因此而大打折扣。 事实上，该过程是细胞的受控组装与细胞自组装相结合的一个动态变化过程，初始的细胞精确装配可能并非是必要的，而了解装配后细胞的迁移、聚集及自组装的机理和转变过程更为必要。可以这样说，受控组装为细胞或多种细胞提供了一个结构的初始状态，在体外培养下，最终状态如何则取决于细胞的自身行为。 在以上假设基础上，可以降低对精度的要求，从而转向效率更高的装配方式，其中适合于用三维打印技术来装配的单元包括：微组织和细胞-材料微丝单元，本论文采用了细胞-材料微丝单元来构建三维组织。
生物制造技术小结
综述了目前常见的各种生物制造技术，根据基于支架技术路线和无支架技术路线，对各种技术进行了分类，并根据技术所处的制造尺度分析了相应的技术特。
生物3D打印技术深入解读之一http://www.nanjixiong.com/thread-43724-1-1.html
生物3D打印技术深入解读之二http://www.nanjixiong.com/thread-43797-1-1.html
生物3D打印技术深入解读之三http://www.nanjixiong.com/thread-43870-1-1.html
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